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能量可控陡脉冲电穿孔生物学效应的实验研究

杨孝军  
【摘要】:以细胞膜电穿孔效应为核心的电化学治疗已开展 20 余年,其主要机理为脉冲电场的膜穿促进外源药物、抗体或基因向胞内弥散。本课题组在能量可控陡脉冲肿瘤治疗系统的前期研究中,已证实高能陡脉冲电场能使肿瘤细胞膜发生不可逆性电穿孔,从而导致肿瘤细胞的直接死亡。本研究中,通过三个部分的研究对陡脉冲的致活体细胞的膜穿效应作更深入的探讨,对陡脉冲研制中某些关键问题作定性及定量的研究。 第一部分中为研究亚致死量陡脉冲对人卵巢癌细胞耐药亚株的杀伤及对多药耐药性的调节,并探讨其可能的机制。设计以人卵巢癌亲本株 SKOV3 及耐阿霉素(adriamycin, ADM)的多药耐药亚株SKOV3/ADM 为研究对象,行陡脉冲电击处理后,MTT 法检测两细胞亚株的电敏感性及化疗敏感性;逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)法检测耐药亚株中多药耐药基因 MDR1mRNA 水平,免疫细胞化学检测其P-gp 蛋白表达;电镜观察超微结构的改变。结果得出 SKOV3 亲本及耐药亚株对陡脉冲电场的电敏感性相近(P=0.642);亚致死量脉冲处理细胞后,耐药亚株的化疗敏感性增强,IC50 值及耐药指数均减低;MDR1mRNA 水平无显著的改变(P=0.947),P-gp 蛋白表达强度显著 减弱(P=0.001);处理后细胞出现凋亡。因此陡脉冲对 SKOV3 多药耐药亚株亦可有效杀伤;亚致死量陡脉冲能逆转多药耐药,机制可能为陡脉冲电场增加膜渗透性的同时亦可能诱导改变耐药相关蛋白的正常构象与功能。 第二部分中为研究活体内陡脉冲电场的分布模型,探讨建立兔正常肝组织脉冲电场分布模型的可行性,为临床应用提供有效的理论依据。通过观察频率、脉宽固定,电压峰值递增的脉冲电场对 30 只新西兰大白兔正常肝脏的杀伤效应,设计采用重复实验及自身对照,脉冲处理 3d 后取材 HE 染色,光镜下见低脉冲剂量时两电极周围呈同心圆形坏死、界限清晰,剂量增大则同心圆形坏死亦增大,且渐变椭圆梭形,两电极中点处肝细胞出现核固缩、碎裂、溶解样改变,最后两椭圆梭形坏死相互重叠融合成不规则坏死,处理区尚见肝细胞的空化效应及肝组织缺血现象,实验所见与理论模拟的电场分布能较好吻合。而周边组织未见明显的杀伤效应,细胞形态及组织结构完整。因此,本研究建立的在正常兔肝中测定电场分布的方法有很好的可行性,电脉冲在有效杀伤靶区组织的同时对周边正常组织是安全的。 第三部分为能量可控陡脉冲致在体骨骼肌细胞电穿孔的定量实验研究。为摸索兔骨骼肌细胞中陡脉冲的剂量学参数。用核素标记物(99m)Tc-二乙三胺五乙酸来研究能量可控陡脉冲致兔骨骼肌细胞电穿孔的脉冲电参量。用 35 只正常新西兰大白兔的下肢骨骼肌为治疗对象,通过自身对照,治疗前注射一定剂量的(99m)Tc-二乙三胺五乙酸,研究不同脉冲参数治疗后药物进入骨骼肌细胞内的量。结果得出


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