靶向H-ras基因的小干扰性RNA联合能量可控陡脉冲治疗卵巢癌的实验研究

【摘要】：陡脉冲电场对细胞膜的不可逆性电击穿导致的细胞死亡成为了恶性肿瘤低创或微创物理治癌新方式,而对肿瘤边缘残存的有活性肿瘤细胞的补充杀伤则是影响陡脉冲治疗效果的关键。肿瘤是一种以癌基因激活和肿瘤抑制基因失活为特征的基因组功能性疾病,这些基因组功能的改变限制了传统治疗手段的有效性。随着分子生物学、免疫学和病毒学的发展,通过对致瘤基因的抑制或缺陷基因的修复等方法,基因治疗已成为继手术、化疗和放疗之后的可望根治癌症的新方法。ras基因是存在于正常细胞的原癌基因,与细胞的增殖、分化有密切的关系;ras 基因的持续的激活可导致细胞的增殖和永生化。野生型 H-ras基因是一种在卵巢浆液性囊腺癌细胞中高表达的基因,我们运用 RNAi技术沉默其表达后观察细胞增殖、凋亡和肿瘤生长情况,进一步明确H-ras 基因在卵巢癌发生发展过程的作用,并将 H-ras 基因的干扰性RNA 与陡脉冲联合应用解决陡脉冲治疗后瘤细胞的残余和复发问题,为癌症的陡脉冲联合基因治疗提供理论和实验依据。 目的:构建针对卵巢癌高表达的H-ras基因编码区的小发夹状RNA重组质粒载体 pshRNA/H-ras,并行序列分析,为进一步研究 H-ras 基因在卵巢癌发生发展中的作用打下基础。 方法:应用基因克隆技术,设计含 21bp H-ras 基因编码序列片段及中间以 4-5 个 bp 间隔的反向重复序列,经退火形成互补双链,克隆至转录载体 pTZU6+1 上,转化 JM109 菌株,提取重组质粒酶切鉴定并序列分析。 结果:将合成的 DNA 片段成功克隆至载体上,经酶切及 DNA 序列鉴定为正确的目的序列。 结论:靶向 H-ras 基因的发夹状 RNA 干扰重组质粒的成功构建,可进一步研究其对细胞内源 H-ras 基因 mRNA 转录和蛋白质表达的影响,为卵巢癌的基因治疗奠定基础。