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自身淬灭荧光定量PCR检测SARS冠状病毒方法的建立

张国强  
【摘要】:目的:应用新型的自身淬灭荧光引物(LUX Primer)原理及技术,建立一种快速、特异、敏感和准确的定量检测 SARS 冠状病毒 RNA的实时荧光定量 RT-PCR 方法。 方法:根据已公布的 SARS 冠状病毒全基因序列,利用 BLAST,Clustal x,RNAstructure 等软件分析得到 PCR 扩增的靶序列。应用LUX? Designer 软件设计引物,借助计算机辅助,分析其保守性和特异性并进行优化。通过 TA 克隆,将靶序列的 cDNA 克隆到到 pGEM-T载体上,应用 SP6 RNA 聚合酶经体外转录得到靶序列,作为 RT-PCR反应体系优化和评价实验的模板。对 RT-PCR 反应体系中的 Mg2+,dNTP 和引物浓度进行优化。将体外转录得到的 RNA 作为模板,对方法的灵敏度,定量线性范围,精密度等进行评价。 结果: 克隆的片断经测序证实与 SARS 冠状病毒相应序列完全一致。RT-PCR 反应优化体系组成:Mg2+为 3mmol/L, dNTP 的浓度各为 200μmol/L,各引物浓度为 200 nmol/L。退火温度为 55℃。本方法具有最低可检测到每个 RT-PCR 反应管中 9.375 个拷贝体外转录的RNA 分子的灵敏度;在 1.5×106 ~ 1.5×102 copies/μl 浓度范围内具有很好的线性,其 R2值为 0.993;批内重复性:高浓度的 CV 值为0.78% ,低浓度的 CV 值为 1.1% ,批间重复性:高浓度的 CV 值为2.9%,低浓度的 CV 值为 4.1%。 结论:本实验建立的自身淬灭实时荧光定量 RT-PCR 能够快速,准确,敏感地对 SARS 冠状病毒核酸进行定量分析,具有较大的定量


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