HBV cccDNA荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

【摘要】：乙肝病毒感染影响了全球约三亿五千万人口,而且绝大多数为慢性感染,其中约5%最终发展成肝硬化或肝癌,导致每年约有一百万人死于 HBV 感染引起的各种终末期肝病。而我国 HBV 感染人群的比例则更高,据不完全统计在 10%-20%之间。大多数的抗病毒治疗能够成功地将病人外周血中的病毒量降低至检测限以下,但不能清除作为乙肝病毒子代复制模板的 cccDNA,因此,肝细胞内乙肝病毒 cccDNA含量的多少便成为判定 HBV 复制水平和评价抗病毒药物疗效的关键指标。 目的:评估一个新设计的 HBV cccDNA 荧光定量 PCR 检测方法。方法:以肝穿组织为检测标本,采用 LightcycleTM 探针,通过一对特殊引物,使 HBVcccDNA 可以扩增而病毒基因组不能扩增;同时利用一种依赖于 ATP 的特异性 DNase 提高反应的特异性,以此实现对cccDNA 的检测。结果:成功建立了 HBV cccDNA 荧光定量 PCR 的检测方法,线性范围为 2.5×101—2.69×109 拷贝/ml。对五个病例的肝穿样本进行分析,其中三例为乙肝感染患者,并均接受抗病毒治疗达一年,另两例为乙肝阴性患者。检测结果如下:1)两例乙肝阴性患者的肝组织检测结果 cccDNA 及 tDNA 皆为阴性。2)接受拉米夫定治疗一