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抗生素诱导肠道菌群失调与肺部免疫状态的关系

刘崇海  
【摘要】: 在过去的三十年中,哮喘等变应性疾病在世界范围内明显增加。据美国疾病控制和预防中心研究显示,美国哮喘发病率从1980年到1994年增加了75%,以0~4岁儿童增加最明显,高达160%。我国儿童哮喘发病情况亦不容乐观,0~14岁儿童哮喘患病率1990年到2000年10年间从0.78 %上升到2.06 % ,增加了1.6倍。尽管遗传因素与哮喘发生明确相关,由于人类遗传背景短期内不可能发生明显变化,因此哮喘明显增加可能是环境因素改变的结果,这也正是“卫生假说”的观点。卫生假说认为在西方国家由于公共卫生设施改善、疫苗及抗生素使用以及肠道菌群改变,使感染发生率降低,微生物对婴幼儿正在发育的免疫系统刺激作用减弱,造成哮喘等变应性疾病发生率大幅度升高。人类流行病学研究显示,抗生素使用和肠道菌群改变与哮喘发病率升高相关。为了探讨抗生素诱导肠道菌群失调和哮喘的关系,我们建立了抗生素诱导的肠道菌群失调小鼠模型,在该模型上采用烟曲霉菌变应原气道激发,以探讨抗生素所致肠道菌群失调与气道变应性反应的关系,并进一步在实验性哮喘模型上了解肠道菌群失调对哮喘发作严重程度的影响以及在RSV感染动物模型上了解对RSV感染后肺部T辅助细胞极化方向的影响,评价抗生素诱导肠道菌群失调在哮喘等变应性疾病发生中的作用,为哮喘的防治提供理论依据。 目的:采用抗生素头孢哌酮诱导小鼠肠道菌群失调,通过观察小鼠细胞免疫和体液免疫以及TLR2、4基因表达变化,探讨抗生素诱导小鼠肠道菌群失调后对机体适应性免疫和天然免疫的影响。 方法:60只4周龄雌性BALB/c小鼠随机分为2组:抗生素组和对照组,抗生素组小鼠连续7d口服头孢哌酮,第7d经口给予白色念珠菌。对照组用等量生理盐水代替头孢哌酮、白色念珠菌进行实验。第8d每组小鼠随机取10只用于盲肠内容物细菌培养计数、粪便含水量和体重变化的检测,以了解肠道菌群失调情况。其余小鼠用于免疫功能检测,包括脾指数、PHA诱导的脾脏淋巴细胞转化实验、迟发型超敏反应、抗体生成细胞数和PCR测TLR2、4 mRNA表达水平。 结果:⑴抗生素组小鼠肠道内肠杆菌、肠球菌、双歧杆菌、乳酸杆菌较对照组明显减少,白色念珠菌增加,小鼠出现肠道菌群失调伴粪便含水量增加和体重减轻;⑵抗生素组小鼠脾指数(0.0035±0.0002)较对照组(0.0055±0.0008)降低;⑶抗生素组PHA诱导的脾脏淋巴细胞转化率(0.0086±0.0016)较对照组(0.0147±0.0020)减少;⑷抗生素组小鼠经绵羊红细胞攻击后足跖增加的厚度(0.094±0.013mm)较对照组(0.152±0.021mm)少;⑸抗生素组小鼠抗体生成细胞数(0.193±0.004)较对照组(0.215±0.007)低;⑹脾脏的TLR2和TLR4基因表达水平较对照组下调。 结论:抗生素诱导肠道菌群失调后小鼠细胞免疫功能和体液免疫功能以及TLR2、TLR4 mRNA表达均降低,说明天然免疫和适应性免疫应答能力均降低,提示抗生素致肠道菌群失调对机体免疫功能有明显影响。 第二部分抗生素诱导肠道菌群失调与变应性气道反应的关系研究 目的:在抗生素所致肠道菌群失调小鼠模型上采用烟曲霉菌变应原气道激发,诱导气道变应性反应,探讨抗生素诱导肠道菌群失调与气道变应性反应的关系。 方法:40只雌性BALB/c小鼠分为4组,每组10只。①抗生素组:口服头孢哌酮7 d,第7d给予50μl白色念珠菌1次,9、16 d经鼻给予50μl生理盐水;②激发组:1~7 d给予等量生理盐水代替头孢哌酮和白色念珠菌,9、16 d经鼻给予烟曲霉菌变应原50μl;③抗生素加激发组:前7d处理同抗生素组,9、16 d经鼻给予烟曲霉菌变应原50μl;④对照组:1~7 d给予等量生理盐水代替头孢哌酮和白色念珠菌,9、16 d经鼻给予50μl生理盐水。所有小鼠于第19d检测BALF中细胞总数和分类计数、细胞因子INF-γ和IL-4水平、肺部病理和转录因子GATA-3和T-bet mRNA表达。 结果:⑴激发组和抗生素加激发组小鼠BALF中细胞总数、淋巴细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞增加,尤以抗生素加激发组小鼠更为明显;⑵抗生素加激发组小鼠BALF中IL-4(45.35±2.36pg/ml)水平较对照组(35.32±2.53 pg/ml)增加,IFN-γ水平无明显变化;⑶4组小鼠肺组织病理学显示均无明显炎症浸润;⑷肺组织中转录因子GATA-3 mRNA表达水平(0.57±0.023)比对照组(0.41±0.020)高,T-bet/GATA-3比值(0.58±0.021)较对照组(0.80±0.035)降低。 结论:抗生素致肠道菌群失调小鼠经过烟曲霉菌变应原气道激发,可致Th2优势的气道变应性反应,提示抗生素致肠道菌群失调是诱发哮喘等变应性疾病发生的危险因素。 第三部分抗生素诱导肠道菌群失调在实验性小鼠哮喘模型上的效应观察 目的:采用OVA致敏和激发建立实验性哮喘模型,在致敏阶段用抗生素诱导肠道菌群失调,探讨抗生素致肠道菌群失调对哮喘发作严重程度的影响。 方法:54只小鼠分为3组,每组18只。哮喘组采用OVA致敏和激发;抗生素加哮喘组也采用OVA致敏和激发,在OVA致敏过程中加用抗生素和白色念珠菌诱导肠道菌群失调;对照组采用对照佐剂致敏和PBS激发,处理同哮喘组。激发结束后检测BALF中细胞总数和分类计数,ELISA检测细胞因子IFN-γ和IL-4水平、肺组织病理评分以及流式细胞仪检测肺部DC亚型和成熟度。 结果:⑴经过OVA致敏和激发,小鼠出现喘息症状,BALF中细胞总数、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、中性粒细胞和巨噬细胞均较对照组显著升高,IFN-γ水平降低,IL-4水平升高,肺组织可见明显炎症,说明OVA致敏和激发建立的实验性哮喘模型成功;⑵和哮喘组比较,抗生素加哮喘组小鼠喘息症状、BALF中细胞总数和分类计数、IFN-γ和IL-4水平、肺部病理评分以及肺部DC亚型无显著差异;肺部DC成熟度有显著差异。 结论:抗生素诱导肠道菌群失调在实验性哮喘模型上对肺部DC成熟度有明显影响,但抗生素诱导肠道菌群失调对肺部免疫状态的影响很小,不足以影响哮喘发作的严重程度。 第四部分抗生素诱导肠道菌群失调在RSV感染小鼠模型上对肺部免疫状态的影响 目的:在RSV感染小鼠模型上采用抗生素致肠道菌群失调后,烟曲霉菌变应原气道激发诱导气道变应性反应,探讨感染RSV后用抗生素诱导肠道菌群失调对RSV感染后肺部Th1/Th2极化方向的影响。 方法:54只BALB/c小鼠分为3组,每组18只。RSV组小鼠鼻腔接种RSV,感染后9d和16d经鼻给予烟曲霉菌变应原气道激发;抗生素加RSV组小鼠鼻腔接种RSV后连续口服抗生素头孢哌酮7d,感染后7d经口给予白色念珠菌,感染后9d和16d进行烟曲霉菌变应原气道激发。对照组小鼠鼻腔滴入等量病毒培养液,滴鼻后9d和16d进行烟曲霉菌变应原气道激发。RSV感染后19d检测BALF中细胞总数和分类计数,ELISA检测细胞因子水平、肺组织病理评分以及流式细胞仪检测肺部DC亚型和成熟度。 结果:⑴小鼠感染RSV后,BALF接种到Hep-2细胞可以引起典型CPE,直接免疫荧光证实肺部有RSV抗原,BALF中细胞总数升高,以淋巴细胞增加为主,肺部可见明显炎症,说明RSV感染小鼠模型建立成功;⑵与RSV组比较,抗生素加RSV组小鼠BALF中细胞总数和分类计数、IL-4、IL-10和IFN-γ水平、肺部病理评分以及肺部DC亚型和成熟度无显著差别。 结论:抗生素诱导肠道菌群失调和气道变应原激发并不改变RSV感染后肺部Th1/Th2细胞的极化方向。


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