收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

超声微泡介导HGF治疗大鼠心肌梗死的实验研究

李兴升  
【摘要】: 冠心病(CHD)是严重威胁人类生命和健康的常见疾病。虽然经皮冠脉成形术(PTCA)和冠状动脉旁路移植术(CABG)挽救了很多患者的生命,但部分严重患者的病情并未因此得到明显改善。近年来基因治疗迅速发展,为冠心病患者提供了一个新的治疗策略,但目前由于尚缺乏一种安全、稳定、高效的基因转染方法,而极大地限制了基因治疗在临床上的广泛应用。新近研究发现,超声靶向破坏微泡定位释放技术(Ultrasound-targeted microbubble destruction, UTMD)是一种新型的无创性基因转移技术。开展对UTMD介导目的基因靶向治疗的深入研究可望为冠心病的基因治疗带来新的治疗措施。 本课题是通过构建携有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和肝细胞生长因子(HGF)基因的真核共表达载体(pIRES2-EGFP/HGF),制备一种能与pIRES-EGFP/HGF基因高效结合的超声微泡造影剂,然后运用超声靶向破坏微泡(UTMD)介导HGF治疗大鼠心肌梗死,观察治疗后EGFP及HGF基因在缺血心肌内的表达情况及治疗效果?,为研究和评价超声靶向破坏微泡介导的心脏基因转染提供可靠的实验依据,为冠心病基因治疗提供一个新的途径和手段。本?课题研究主要包括以下三个部分的内容: 第一部分增强型绿色荧光蛋白与肝细胞生长因子共表达载体的构建及鉴定 目的构建增强型绿色荧光蛋白与人肝细胞生长因子的基因真核共表达载体并鉴定其在真核细胞中的表达。方法在HGF两端设计并合成分别带有SacⅠ和BamHⅠ两酶切位点的一对引物,对pcDNA3.0-HGF载体进行PCR扩增,将扩增出的目的基因与pMD18-T载体相连接,并转化至大肠肝菌,进行菌落PCR、酶切分析和DNA测序鉴定重组克隆。用SacⅠ和BamHⅠ将目的基因片段用双酶切切下后,纯化提取凝胶中的目的DNA片断,然后插入pIRES2-EGFP相应的酶切位点,构建pIRES2-EGFP/HGF真核表达载体并再进行双酶切鉴定。将重组质粒用脂质体法转染至人血管内皮细胞(HUEVC)中,荧光显微镜下观察EGFP在细胞内的表达,Western blot检测HGF蛋白的表达情况。结果重组克隆载体内的目的基因片段序列与GENEBANK上报道的HGF基因序列完全一致,pIRES-EGFP/HGF酶切鉴定结果与预期结果一致。荧光显微镜下观察可见转染后的细胞发出绿色荧光;Western blot结果表明HGF基因得到了有效表达。结论本实验成功构建EGFP和HGF真核共表达载体并可在真核细胞中有效表达。 第二部分载基因脂质超声造影剂的制备及其特性的实验研究 目的制备一种可作为基因载体的脂质超声造影剂,对其理化性质、兔肾显影效果及载基因能力进行研究。方法采用机械振荡法制备一种可作为基因载体脂质超声微泡造影剂,观察60 Coγ射线灭菌前后造影剂外观、形态、浓度、平均粒径和电位改变,并观察其对正常兔肾显影效果,检测其结合基因的能力。结果自制脂质微泡的平均粒径范围为2.11~6.43μm,平均粒径2.79μm,粒径分布均匀,浓度约为(3.16±0.29)×109个/ml;经60Coγ射线灭菌后在显微镜下观察微泡形态,粒径大小及电位等均无明显变化;体内造影显示该造影剂能够有效增强兔肾实质回声;基因结合量效优化结果显示,造影剂的最大基因结合效率为22%,最大基因结合量为0.45 mg/ml。结论自制脂质超声造影剂符合理想超声造影剂的要求,性质稳定,制备简易,载基因效率高,可望成为一种新型的超声微泡造影剂以及基因或药物治疗的载体。 第三部分超声靶向破坏微泡介导HGF促进大鼠梗死心肌血管新生的实验 目的探讨超声靶向破坏微泡介导HGF促进大鼠梗死心肌血管新生的可行性,并评价其治疗效果。方法将40只Wistar大鼠制备成心肌梗死模型后随机分为4组,即①HGF+超声+微泡组(HGF+ultrasound+ microbubble, HGF+US/MB),②HGF+超声组(HGF+ultrasound group, HGF+US),③HGF+微泡组(HGF + microbubble group,HGF+MB),④单纯手术组(surgery alone group,SA )。①组采用超声心电触发靶向破坏心肌内携基因微泡,②组采用基因联合超声心电触发,而不用微泡,③组只由静脉输入载基因微泡,④组由静脉注入等量生理盐水作为对照。于基因转染后14 d处死各组大鼠,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白在各组大鼠心肌、肝及肾组织内的表达情况,免疫组织化学法(IHC)检测缺血心肌周围CD34的表达,并在显微镜下计数心肌内新生微血管密度(MVD),Western blot和ELISA法检测心肌组织内HGF蛋白表达情况,并对心肌内HGF含量与MVD进行相关性分析。结果荧光显微镜下可见在HGF+US/MB组大鼠心肌中有大量的绿色荧光蛋白的表达,且心室前壁的表达高于后壁,在HGF+US组中仅于小血管及毛细血管的内皮细胞中有少量绿色荧光蛋白的表达,而SA组及HGF+MB组的心肌内无绿色荧光蛋白的表达;各组大鼠肝及肾组织内均未观察到EGFP的表达。IHC结果显示,CD34定位于血管内皮细胞胞膜和胞浆,显示为棕黄色或棕褐色颗粒,新生的微血管被染成棕黄色,显微镜下计数每高倍镜视野下的MVD,结果表明在HGF+US/MB组心肌中MVD最高,为266.9±39.83(个/高倍镜视野),与其它各组相比较均有显著性差异(P0.01)。Western blot检测结果显示:HGF+US/MB组中可见一69 kD大小蛋白条带表达,HGF+US组可见同等大小的弱蛋白条带表达,而在HGF+MB组及SA组中无明显蛋白条带。ELISA结果显示HGF在HGF+US/MB组心肌中表达最高,为5.54±0.81 ng/g,且前壁表达高于后壁(P0.05),与其它各组心肌HGF含量相比较均有显著性差异(P0.01)。相关分析表明,心肌中HGF的含量与MVD呈明显正相关。结论超声靶向破坏微泡可介导HGF基因在缺血心肌内的高效转移并促进血管新生,为心肌梗死的基因治疗提供一个新的措施。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 武云霞;段燕;;HGF在人牙周膜成纤维细胞中的表达[J];临床口腔医学杂志;2011年10期
2 赵跃斌;HGF和瘦素在糖尿病视网膜病变中的作用[J];国外医学.眼科学分册;2003年06期
3 牟姗,张庆怡,倪兆慧,赵涵芳;HGF对高糖诱导肾间质成纤维细胞增殖的影响[J];上海第二医科大学学报;2004年08期
4 吕敬媛;张丹凤;卢北燕;胡玉红;吴英杰;;HGF及其受体的表达与妊娠期高血压疾病的关系[J];黑龙江医药科学;2007年03期
5 张喜梅,张皙,王方,富名水,顾青;增生性玻璃体视网膜病变患者血清和眼内液HGF水平检测[J];眼科研究;2003年06期
6 张宇;陈韶华;钭春凤;饶远权;刘杏娥;王廷详;钦光跃;;HGF在肺腺癌与细支气管肺泡细胞癌的表达[J];浙江预防医学;2008年07期
7 田水;周艳丽;;“治癌灵”穴贴及针刺对H_(22)肝癌小鼠HGF表达的影响[J];辽宁中医药大学学报;2007年05期
8 段海峰,吴祖泽,陆颖,刘红军,哈小琴,吴丹莉,王立生;腺病毒介导的人HGF转染大鼠骨髓间充质干细胞及其作用研究[J];军事医学科学院院刊;2003年04期
9 张喜梅,张皙;增生性玻璃体视网膜病变视网膜前膜超微结构及HGF受体表达[J];国际眼科杂志;2005年03期
10 张延丽;张建华;江朵;;胎盘中HGF和IGF-1的表达及与妊娠期高血压疾病发病的关系[J];中国优生与遗传杂志;2008年01期
11 桑圣刚;荣红;覃西;钱士匀;;NSE和HGF动态检测在新生儿缺氧缺血性脑病中的临床意义[J];海南医学院学报;2010年12期
12 李浩;李沐纯;黄秋林;;IL-10和HGF对大鼠活体肝移植术后急性排斥反应的抑制作用[J];中国医学工程;2008年04期
13 陈尊杰;谢汉彬;黄钥藩;杨仪;陈东锋;;OA联合HGF治疗抗结核药物性肝损伤效果观察[J];中国热带医学;2011年05期
14 何肖;白莉;;HGF和MMP-9在扁平苔藓皮损中的表达及意义[J];医学研究杂志;2011年03期
15 肖琳;唐良萏;;52例HGF在子宫内膜癌组织中的表达及其与血管生成的临床分析[J];重庆医学;2005年12期
16 段晓辉;于艳芳;张艳丽;王延臣;裴志萍;康震;乔国勇;;HGF、c-Met鼻内翻性乳头瘤恶变中的表达变化及其意义[J];实用医学杂志;2012年24期
17 牟娜,张庆怡,倪兆慧,童菊芳;黄芪对高糖作用下肾间质成纤维细胞表达HGF的影响[J];中国中西医结合肾病杂志;2002年01期
18 段燕;武云霞;;TGF-β1对IL-1β诱导人牙周膜成纤维细胞分泌HGF影响的研究[J];中国医疗前沿;2010年23期
19 吴红;向迪乐;杨宇;苏荣华;王锋;杨孝芳;王兴桂;;俞募配穴灸法对慢性肾炎大鼠肝细胞生长因子(HGF)影响的实验研究[J];贵阳中医学院学报;2013年01期
20 郭丽;其木格;;TGFβ1和HGF以及bFGF在妊娠期高血压疾病中的表达及意义[J];内蒙古医学杂志;2010年10期
中国重要会议论文全文数据库 前6条
1 牟姗;张庆怡;赵涵芳;;黄芪对高糖作用下肾间质成纤维细胞表达HGF的影响[A];中国生物化学与分子生物学会第八届会员代表大会暨全国学术会议论文摘要集[C];2001年
2 李俊霞;胡慧瑾;陆化;费小明;李建勇;;硼替佐米对骨髓间充质干细胞迁移能力及趋化相关因子HGF表达的影响[A];第13届全国实验血液学会议论文摘要[C];2011年
3 王保君;郑建奇;李顺元;朱红军;;房水中HGF、TGF—β2含量与青光限发病机制的研究[A];中华医学会第十二届全国眼科学术大会论文汇编[C];2007年
4 肖江强;施晓雷;韩冰;任昊桢;张悦;马虎臣;檀家俊;丁义涛;;慢病毒介导的Tet调控HGF稳定表达的人类骨髓间充质干细胞株的建立及自身诱导向肝细胞定向分化能力的鉴定[A];2012中国器官移植大会论文汇编[C];2012年
5 牟姗;张庆怡;倪兆慧;钱家麒;;HGF对肾脏成纤维细胞增殖及细胞外基质分泌的影响[A];“中华医学会肾脏病学分会2004年年会”暨“第二届全国中青年肾脏病学术会议”论文汇编[C];2004年
6 崔志鸿;杨恬;;HGF可促进毛囊的生长[A];中国细胞生物学学会医学细胞生物学、免疫细胞生物学和发育生物学专业委员会学术研讨会论文摘要汇编[C];2002年
中国博士学位论文全文数据库 前1条
1 李兴升;超声微泡介导HGF治疗大鼠心肌梗死的实验研究[D];重庆医科大学;2007年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 刘举祥;脑脊液中HGF、sICAM-1的含量与不同中枢神经系统疾病关系研究[D];山东大学;2005年
2 张建华;HGF在妊娠期高血压疾病胎盘组织中的表达及与IGF-1的关系[D];山西医科大学;2008年
3 胡哲;益气活血方对大鼠缺血心肌血管新生及HGF影响的研究[D];湖南中医药大学;2012年
4 何肖;HGF和MMP-9在扁平苔藓皮损中的表达及意义[D];山西医科大学;2011年
5 段燕;TGF-β1对IL-1β诱导人牙周膜成纤维细胞分泌HGF影响的研究[D];山西医科大学;2011年
6 仝春梅;豚鼠实验性近视眼视网膜色素上皮细胞HGF表达变化及钙离子的研究[D];河北医科大学;2009年
7 陈洪流;罗格列酮钠对实验性糖尿病大鼠残存胰岛表达HGF的影响[D];广西医科大学;2007年
8 李志峰;载HGF的PLA-O-CMC纳米粒子的制备、表征及其对培养大鼠肝细胞活力和功能的影响[D];南通大学;2008年
9 高玉芳;HGF促动脉血管形成的机理研究[D];兰州大学;2009年
10 赵鸿鹏;HGF、MMP-2和MMP-9在胰腺癌中的表达及其临床意义研究[D];山东大学;2006年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978