子宫内膜雌激素受体a基因多态性及表达与原因不明月经过少的关系研究

【摘要】： 每周期总经量少于30毫升,称为月经过少,是妇科常见症状。临床上导致月经过少的原因多为①子宫内膜损伤,②雌激素水平下降,③先天性子宫发育不良等。但我们对月经过少患者行宫腔镜检查,发现不少患者的子宫内膜光滑菲薄,表现为生长发育不良。与传统的子宫内膜损伤、疤痕学说不吻合。检测性激素水平在正常范围,性激素替代治疗无效,我们称之为原因不明月经过少。这类患者常因孕卵不易在子宫内膜种植,导致反复流产、不孕。用辅助生殖技术的成功率极低,即使妊娠成功,也极易流产,严重影响了患者的身心健康。对此类患者的治疗,已成为目前临床上十分棘手的问题。 雌激素是调节月经的主要激素,雌激素主要通过与雌激素受体结合而发挥其生物学效应。作用体现在:一方面促进子宫内膜血管的周期性重建;另一方面促进子宫内膜的增生修复。原因不明月经过少病人雌激素水平正常,是否雌激素受体环节出现障碍?我们前期以免疫组化法检测子宫内膜雌激素受体(estrogen receptor,ER),发现原因不明月经过少患者ER表达较月经量正常妇女者明显减少。 ER分ERa和ERβ两个亚型。在ERa基因上游有多种多态性位点存在,其中PvuII和XbaI 2个限制性片段长度多态性的确切酶切位点已被确定,其位于1号内含子,1号内含子含有增强子、启动子等重要序列,其中发生的点突变有可能影响到ERa的表达与功能。而且ERa基因上游1Kb处存在T(thymine),A(adenine)重复序列,它属于基因的调控区,对基因表达起调控作用。Nilsson M认为ER基因多态性(gene polymorphismss)可能导致基因在转录、翻译水平失调,导致ERa表达、功能异常。 目前对雌激素受体基因多态性与妇科激素依赖性疾病相关性的研究较为普遍,如:习惯性流产,卵巢功能障碍,子宫内膜异位症,子宫内膜癌等。但国内外尚无雌激素受体基因多态性与月经过少关系的研究报道。本研究拟从原因不明月经过少患者ERa基因多态性及其表达,探讨原因不明月经过少的发病机制,为进一步深入研究和治疗提供理论依据。 第一部分雌激素受体a基因PvuⅡ、XbaⅠ多态性与原因不明月经过少的关系 目的:探讨重庆地区雌激素受体a基因PvuⅡ、XbaⅠ多态性与原因不明月经过少的关系。 方法:选择重庆地区100名原因不明月经过少患者为实验组,100名月经正常者作为对照组。应用PCR-限制性片段长度多态性(PCR-restriction fragment length polymorphisms, PCR-RFLP)的方法分析ERa基因1号内含子PvuⅡ、XbaⅠ多态性,观察ERa基因多态性在实验组与对照组中的分布,分析各基因型、等位基因型及单倍体型特征,比较ERa基因各基因型与年龄、人流次数等指标的关系。 结果:实验组ERa基因Pvu II基因型PP, Pp, pp频率与对照组相比差异有显著性(χ2=14.915, P=0.001 )。P基因型频率实验组为47.5%,对照组为30.5% ,OR值: 2.062(95%CI= 1.369～3.105), P=O.001;X基因型频率实验组为20.5%,对照组为30.5%,OR值:0.588 (95%CI=0.372～0.928),P=0.022。PvuII和XbaI限制性片段长度多态性在两组中均呈多态性分布。实验组Ppxx基因型构成比(36%)高于对照组(15%),而ppXx、ppxx基因型构成比(4%、19%)低于对照组(20%、29%)。原因不明月经过少患者ERa基因不同基因型与年龄的比较,差别无统计学意义;而与人流次数的比较,差别有统计学意义。 结论: ERa基因多态性与原因不明月经过少有关, P等位基因可能是其危险因素;X等位基因可能是其保护因素。Ppxx基因型可能是原因不明月经过少潜在危险因素。原因不明月经过少患者ERa基因的PvuⅡ基因型及XbaⅠ基因型与年龄无相关,而与人流次数相关。 第二部分雌激素受体a基因TA重复序列多态性与原因不明月经过少的关系 目的:研究雌激素受体a基因TA二核苷酸重复序列多态性与原因不明月经过少的关系。 方法:选择重庆地区的100名原因不明月经过少患者为实验组,100名月经正常者作为对照组。对雌激素受体基因上游的高变区二核苷酸(TA)重复序列进行纯化、克隆和序列分析,研究TA重复序列的多态性在实验组与对照组中的分布情况,将TA重复序列多态性与年龄、人流次数等指标进行比较。 结果:共分离出7种等位基因,其(TA)n重复数目为11至17,对照组和实验组的(TA)n重复序列等位基因的分布频率不同,差异有显著性(χ2=27.717,P0.001)。再用Fisher's确切概率法比较两组各等位基因的分布频率:对照组中最常见的等位基因为TA14;实验组TA13等位基因频率(33 % )高于对照组(12 % ) ,差异有显著性(P=0.001),OR=3.612 (1.735～7.519);TA15等位基因频率(13%)低于对照组(31%),差异有显著性(P=0.003),OR=0.333(0.162～0.684)。原因不明月经过少患者ERa基因不同TA等位基因型与年龄和人流次数的差别均无统计学意义。 结论: ERa基因TA重复序列多态性与原因不明月经过少有关; TA13等位基因可能是原因不明月经过少的危险因素;TA15等位基因可能是其保护因素。原因不明月经过少ERa基因的不同TA等位基因型与患者的年龄无相关;与人流次数亦无相关,可能是TA等位基因型较多,而样本量相对较少之故。 第三部分原因不明月经过少子宫内膜雌激素受体a表达 目的:通过比较ERa在原因不明月经过少和月经量正常子宫内膜组织中的表达,探讨ERa在原因不明月经过少发生、发展中的意义。从而了解原因不明月经过少的发病机制及影响预后的因素,为临床早预防、早诊断、早治疗并改善预后提供理论依据。 方法:从上述两组人群中分别选取原因不明月经过少子宫内膜组织40例,月经量正常子宫内膜组织40例,标本保存于液氮或-70℃低温冰箱。通过逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR),半定量检测雌激素受体amRNA在子宫内膜组织中的表达。从冻存组织中提取蛋白质,运用Western印迹法半定量检测雌激素受体a蛋白在子宫内膜组织中的表达。分析实验组与对照组ERamRNA及蛋白的表达情况,将年龄、人流次数、ERa基因的各基因型、等位基因型与子宫内膜ERamRNA及蛋白的表达之间分别进行比较。 结果:实验组ERamRNA表达量为0.8879±0.2741,对照组为1.2630±0.3532,实验组ERa-mRNA比对照组表达下调,差异有统计学意义(t=-2.653,P=0.016)。实验组ERa蛋白质表达量为600.8100±212.8439,对照组为797.2750±85.3860,实验组ERa-蛋白质比对照组表达下调,差异有统计学意义(t=-2.709,P=0.014)。两组人群不同年龄ERa表达比较,差别无统计学意义。实验组不同人流次数ERa表达的比较,差别有统计学意义(F=4.985,P=0.019)。人流≥3次与2次人流、1次人流均有统计学意义(P分别为0.035、0.007)。实验组PP基因型ERa-mRNA表达(0.7843±0.1690)比pp基因型(0.9857±0.1345)表达下降(P=0.039),实验组PP基因型ERa-蛋白质表达(544.0170±118.9401)比pp基因型表达(672.5840±150.1515)下降(P=0.035)。实验组xx基因型ERa-mRNA表达(0.7629±0.1727)比XX基因型表达(0.9671±0.1531)下降(P=0.028),实验组xx基因型ERa-蛋白质表达(540.0580±123.5944)比XX基因型表达(659.9980±148.8788)下降(P=0.046)。两组TA重复序列基因型ERa表达差异均无统计学意义(t值分别为-0.5.8、-0.866;P值分别为0.618、0.398)。 结论:原因不明月经过少患者ERamRNA及蛋白在子宫内膜中的表达低于月经量正常子宫内膜,其可能与月经量减少有关。原因不明月经过少患者子宫内膜ERa的表达与年龄无关,而与人流次数有关,人流次数多,患病风险增高。在子宫内膜中,ERaPP基因型比pp基因型的ERa表达下降、xx基因型比XX基因型的ERa表达下降可能导致原因不明月经过少。