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谷氨酰胺强化的早期肠内营养对肝移植大鼠肠粘膜屏障保护作用的研究

李洋  
【摘要】: 目的原位肝移植(Orthotopic liver transplantation, OLT)在治疗終末期肝病(end-stage liver disease, ESLD)方面取得了巨大成功,但是肝移植术后早期(术后30d内)感染仍为影响患者生存的重要因素。其中,脓毒症(Sepsis)一直是术后死亡的重要原因之一,研究证实其发生主要可能与全肝血流阻断再灌注导致肠粘膜屏障损害引起的细菌移位(bacterial translocation, BT)和肠源性内毒素血症(enterogenous endotoxemia)有关。 肠粘膜屏障包括机械屏障、化学屏障、生物屏障、免疫屏障,每一个屏障对消化道粘膜起着重要的防御作用。肠道是外科应激的中心器官,肠粘膜屏障损伤引起的细菌和内毒素移位,具有在各种应激损伤所导致的全身炎症反应综合征(Systemic inflammatory response syndrome, SIRS)乃至多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome, MODS)的中心地位。因此,保护肠粘膜屏障具有重要的临床意义。 目前,临床上大多数肝移植采用非静脉转流的经典原位肝移植,在肝移植无肝期,门静脉系统和胃肠道大约要经历45-60min或更长的淤血,使小肠粘膜很容易发生充血和缺血再灌注损伤(Ischemia-reperfusion injury, I/RI),导致大量氧自由基释放、巨噬细胞核因子-κB (Nuclear factor-κB, NF-κB)活化致肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α, TNF-α)、细胞间粘附分子-1(Intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1)等一系列细胞因子的转录和表达,进一步加重肠粘膜屏障受损,肠粘膜通透性增加,发生细菌和内毒素移位,引起内源性感染、SIRS和MODS,从而增加肝移植死亡率。因此,维护肠粘膜屏障功能,改善肠粘膜的营养状态和减少肠源性感染,对于肝移植病人尤其是使用免疫抑制剂的病人非常重要。 目前尚无对肠粘膜屏障功能障碍治疗的有效措施。近年研究表明,对严重创伤、严重感染等危重病人给与谷氨酰胺(Glutamine, Gln)强化的早期肠内营养(Early enteral nutrition, EEN)(肠内营养混悬液中加入Gln),不仅满足了机体对营养的需要,而且Gln为肠粘膜提供了营养底物,改善了肠粘膜血流供应,能维持肠道免疫活性和肠粘膜细胞的正常结构、细胞间连接和绒毛的高度,预防和减轻肠粘膜屏障损害的发生;同时Gln强化的肠内营养更符合代谢生理,有利于蛋白质合成和代谢调节;促进肠道固有菌丛生长和肠道细胞正常分泌SIgA,有利于防止内毒素释放,大大减少肠源性感染的发生,从源头上控制SIRS的发生,进而降低MODS的发生,从而达到提高生存率的目的。 关于Gln强化的EEN对肝移植肠粘膜损伤是否具有保护作用目前研究较少。因此,本研究在成功建立大鼠原位肝移植模型的基础上,围手术期早期应用Gln强化的肠内营养混悬液能全力进行肠内营养,通过检测反映肠粘膜屏障状况的相关指标的动态变化,从免疫学、分子生物学和微生态学等领域系统探讨肝移植肠粘膜屏障的损伤状况以及Gln强化的EEN能否对肝移植肠粘膜损伤具有保护作用,为减轻肝移植肠道损伤,减少肝移植并发症,提高其存活率采取有效措施提供动物实验依据,具有重要的临床意义。 方法健康雄性Wistar大鼠,随机分为正常对照组(Control组)、原位肝移植组(OLT组)和原位肝移植+Gln强化的早期肠内营养组(EEN组)。以未经任何处理的大鼠为正常对照组;EEN组受体术前第3d、第2d、第1d及术后3h开始给予肠内营养混悬液能全力(125ml/d/kg)+谷氨酰胺(0.3g/d/kg)灌胃,均匀分6次给予,期间自由饮水,直至动物处死为止。OLT组受体于相应时间点按同样方法给予等容积的生理盐水。以未经任何处理的大鼠为供体,两袖套法建立大鼠原位肝移植模型。按肝移植后12h、24h和72h分为三个亚组。于每个时间点采集血液和组织标本。用Limulus Amebocyte Lysate(LAL) Pyrochrome Kit,采用终点法检测门静脉血浆内毒素水平;酶学分光光度法检测门静脉血浆D-乳酸含量;酶联免疫吸附法(ELISA)测定下腔静脉血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量;光镜及电镜检查回肠粘膜的病理改变情况;硫代巴比妥酸法测定肠粘膜丙二醛(MDA)含量;放射免疫测定肠组织中分泌型免疫球蛋白A(sIgA)含量;取门静脉血,肠系膜淋巴结(MLN)、肝、脾组织作细菌培养;免疫组织化学法检测肠粘膜NF-κB、ICAM-1的表达;荧光定量PCR和Western blotting检测肠组织TNF-αmRNA和TNF-α蛋白表达水平。 结果⑴肝移植后12h、24h和72h ,OLT组内毒素水平分别为0.427±0.092, 0.907±0.057和0.803±0.052EU/ml, EEN组分别为0.413±0.056, 0.617±0.049和0.406±0.043EU/ml,均明显高于正常对照组0.109±0.017 EU/ml (P0.01);EEN组24h、72h分别与OLT组24h、72h比较,有显著性差异(P0.01),分别下降32.0%、49.4%。⑵肝移植后12h、24h和72h,OLT组D-乳酸含量分别为1.23±0.12, 2.30±0.12和1.92±0.11μg/ml, EEN组分别为1.22±0.11, 1.78±0.10和1.23±0.08μg/ml,均明显高于正常对照组0.48±0.07μg/ml (P0.01);EEN组24h、72h分别与OLT组24h、72h比较,有显著性差异(P0.01),分别下降22.6%、35.9%。⑶肝移植后12h、24h和72h,OLT组血清TNF-α含量分别为107.06±7.47, 759.04±24.14和569.17±26.70pg/ml, EEN组分别为102.28±9.61, 715.50±25.73和521.13±20.86pg/ml,均明显高于正常对照组15.98±2.07 pg/ml (P0.01);EEN组24h、72h低于OLT组24h、72h,有显著性差异(P0.01),分别下降5.74%、8.44%。⑷肝移植后12h、24h和72h,光镜下见OLT组回肠粘膜弥漫性重度糜烂、坏死脱落,绒毛间隙增宽,固有层水肿,大量炎性细胞浸润,粘膜变薄,以24h最重;而EEN组轻度糜烂,灶性坏死、只有轻度水肿和少量炎性细胞浸润;OLT组绒毛长度分别为276.5±16.9, 152.1±11.3和199.3±11.6μm, EEN组分别为283.9±15.7, 228.1±14.9和289.9±10.8μm,均明显低于正常对照组383.3±14.1μm (P0.01);但EEN组24h、72h明显高于OLT组(P0.01),分别是后者的1.50、1.45倍。透射电镜下见OLT组24h肠粘膜上皮细胞间隙增宽、细胞溶解,微绒毛坏死、脱落,而EEN组上皮细胞间隙基本正常、线粒体轻度肿胀、微绒毛轻度空泡化和局部坏死脱落。⑸肝移植后12h、24h和72h,OLT组肠粘膜MDA含量分别为18.95±1.33, 37.13±1.46和31.30±1.12nmol/mg.prot, EEN组分别为17.91±1.12, 24.88±1.10和19.40±0.91nmol/mg.prot ,均明显高于正常对照组8.21±0.61 nmol/mg.prot (P0.01);EEN组12h、24h和72h分别与OLT组12h、24h和72h比较,有显著性差异(P0.01),分别下降5.5%、33.0%、38.0%。(6)肝移植后12h、24h、72h,OLT组肠粘膜SIgA含量分别为0.733±0.036, 0.546±0.042和0.580±0.037μg/ml, EEN组分别为0.755±0.039, 0.722±0.029和0.905±0.030μg/ml,除了EEN组72h与正常对照组无显著性差异外,其余各组明显低于正常对照组0.887±0.045μg/ml (P0.01);EEN组24h、72h分别与OLT组24h、72h比较,有显著性差异(P0.01),分别是后者的1.32、1.56倍。⑺肝移植后12h、24h和72h,OLT组肠道细菌脏器移位率分别为52.50%、82.50%和72.50%,EEN组分别为47.50%、45.00%和32.50%,均明显高于正常对照组5.00% (P0.00227),EEN组24h、72h明显低于OLT组24h、72h (P0.00227),分别下降了45.5%、55.2%。⑻免疫组织化学结果显示:肝移植后12h、24h和72h,OLT组肠组织NF-κB表达光密度值分别为0.1494±0.0167、0.2018±0.0139和0.1623±0.0142,EEN组分别为0.1119±0.0091、0.1437±0.0102和0.1087±0.0109,均明显高于正常对照组0.0606±0.0147 (P0.01);肝移植后12h、24h和72h,OLT组肠组织ICAM-1表达光密度值分别为0.1380±0.0136、0.1750±0.0086和0.1604±0.0077,EEN组分别为0.1097±0.0064、0.1289±0.0075和0.1086±0.0050,均明显高于正常对照组0.0464±0.0053 (P0.01);NF-κB主要表达于表面上皮和隐窝上皮细胞,亦表达于血管内皮细胞;ICAM-1主要表达于上皮细胞或小血管内皮细胞; EEN组12h、24h和72h NF-κB、ICAM-1表达明显低于OLT组12h、24h和72h (P0.01)。⑼荧光定量PCR结果表明:肝移植后12h、24h和72h,OLT组肠组织TNF-αmRNA表达分别为4.20±0.23, 9.40±0.19, 5.43±0.27×104copies/μgRNA , EEN组分别为3.01±0.10, 5.54±0.19, 2.61±0.14×104copies/μgRNA,均明显高于正常对照组(P0.01);但EEN组12h、24h和72h TNF-αmRNA表达明显低于OLT组12h、24h和72h (P0.01),分别下降28.3%、41.1%、51.9%。⑽Western blotting结果表明:肝移植后12h、24h和72h均可检测到TNF-α蛋白表达,但EEN组表达强度明显减弱;半定量分析结果:OLT组TNF-α蛋白分别为1.75,3.40,2.79,EEN组分别为1.32,2.08,1.36,EEN组与OLT组相比分别下降24.6%、38.8%、51.3%。 结论⑴原位肝移植无肝期导致肠淤血和肠缺血再灌注损伤,引起肠粘膜上皮细胞脂质过氧化反应,肠粘膜MDA含量增加、SIgA水平降低,同时激活肠粘膜巨噬细胞NF-κB活性,产生TNF-α、ICAM-1等细胞因子,使肠粘膜屏障功能受到严重损害,表现在以下几个方面:①机械屏障受损:上皮细胞肿胀,细胞间隙增宽,绒毛坏死脱落,萎缩变短;②生物屏障和免疫屏障受损:表现为细菌和内毒素移位;③肠通透性增加,血D-乳酸含量升高。 ⑵Gln强化的EEN能改善肝移植大鼠肠粘膜血供,降低肠粘膜MDA的产生,有助于肠道细胞正常分泌SIgA,抑制肠粘膜巨噬细胞NF-κB活性,减少TNF-α、ICAM-1等细胞因子的产生,从而改善肝移植肠粘膜损伤情况,明显抑制细菌和内毒素的移位。但其更多机制仍有待进一步研究和探讨。 根据以上实验结果,我们推测对于临床肝移植病人,围手术期早期运用Gln强化的肠内营养,能减少肠源性感染的发生,对提高肝移植存活率具有重要的意义。


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