GLS/IL-12重组沙门菌抗肿瘤的实验研究

【摘要】： 肿瘤是一类严重危害健康、影响生活质量的重大疾病。目前全球每年因癌症死亡的人数约为760万,70%以上发生在低收入和中等收入国家。在我国肿瘤死亡已位居各类死因第一位,每年死于肿瘤的人数约150万。基因治疗是近年来,随着细胞生物学和分子生物学理论和技术的飞速发展继手术治疗、放射治疗和化学治疗后的一种新型治疗手段。目前,肿瘤的基因治疗已成为备受瞩目的研究领域。 课题设计构建了能分泌表达促凋亡因子(GLS)和免疫调节因子(白细胞介素-12)的真核共表达质粒pBudCE4.1-S9K/mIL-12,并构建了能将该质粒递送到肿瘤组织的重组沙门菌,在小鼠黑色素瘤模型上观察了局部注射和口服给予重组沙门菌的抗瘤作用。 第一部分人GLS活性肽和小鼠IL-12基因真核共表达质粒pBudCE4.1-S9K/mIL-12的构建及表达 目的:构建能分泌表达人GLS活性肽和小鼠IL-12的真核共表达质粒pBudCE4.1-S9K/mIL-12,并检测其表达。 方法:将GLS分泌肽的编码序列加入到引物序列中,以含GLS基因(不含分泌肽)的质粒pZMO3为模板,采用PCR扩增出含分泌肽基因的人GLS活性肽基因。然后定向克隆入真核共表达质粒pBudCE4.1的多克隆位点,构建GLS活性肽的真核表达质粒pBudCE4.1-S9K,测序确认正确。将其转染细胞后,以反转录PCR(RT-PCR)和免疫细胞化学法分别检测mRNA水平和蛋白水平的表达。将质粒pZMO2中的小鼠白细胞介素12(murine interleukin 12, mIL-12 )亚克隆到pBudCE4.1-S9K ,构建真核共表达质粒pBudCE4.1-S9K/mIL-12。转染细胞后,以RT-PCR, DOT-ELISA和ELISA检测试剂盒检测GLS和mIL-12的表达与分泌。 结果:成功扩增出含分泌肽编码序列的人GLS活性肽基因。构建的真核表达质粒pBudCE4.1-S9K经PCR,双酶切和双向测序鉴定基因序列完全正确。pBudCE4.1-S9K转染细胞,经RT-PCR扩增出特异性267bp左右的目的条带;经免疫细胞化学检测到转染细胞内明显的棕黄色表达颗粒。真核共表达质粒pBudCE4.1-S9K/mIL-12转染细胞,经RT-PCR扩增出特异性267bp和1632bp左右的GLS基因和mIL-12基因条带;转染细胞上清中用ELISA试剂盒检测到mIL-12的分泌;转染细胞上清用DOT-ELISA检测出现明显的斑点。 结论:成功构建能分泌表达人GLS活性肽和小鼠IL-12的真核共表达质粒pBudCE4.1-S9K/mIL-12。 第二部分人GLS活性肽和小鼠IL-12基因真核共表达质粒pBudCE4.1-S9K/mIL-12的体外抗瘤效应 目的:检测人GLS活性肽和小鼠IL-12基因的真核共表达质粒pBudCE4.1-S9K/mIL-12对肿瘤细胞的影响。方法:将pBudCE4.1-S9K/mIL-12转染小鼠黑色素瘤细胞B16,先以RT-PCR检测肿瘤细胞内GLS的表达,然后采用MTT法检测其对肿瘤细胞的增殖抑制作用;用Hoechst 33258,细胞坏死/凋亡/正常细胞鉴别试剂盒(AO/EB)染色观测肿瘤细胞的凋亡;用Annexin V-FITC和碘化丙啶双染检测细胞凋亡早期细胞膜的变化,流式细胞术检测凋亡细胞的数量。 结果:用RT-PCR检测到GLS在B16中表达的特异性条带。MTT法检测,GLS明显抑制肿瘤细胞增殖,抑制率达到34.27%。细胞转染48h,用Annexin V-FITC和碘化丙啶双染,流式细胞仪检测,转染pBudCE4.1-S9K/mIL-12质粒的肿瘤细胞处于凋亡期的比率为21.02%,比空质粒对照(凋亡率5.45% )增高了约15.57 %。转染pBudCE4.1-S9K/mIL-12的肿瘤细胞,72h后细胞出泡,细胞核浓缩,致密,碎块状,Hoechst 33258染色成亮蓝色,平均凋亡指数达31.40±4.01%;而空质粒对照细胞核形态正常,染色浅淡,凋亡指数为5.70±1.64%。转染后48小时和72小时,肿瘤细胞经AO/EB染色在荧光显微镜下区分正常细胞、坏死细胞和凋亡细胞。正常细胞被染成绿色,细胞与胞核形态正常。坏死细胞由于失去了核膜的完整性,细胞核被溴化乙锭染成红色。而凋亡细胞胞特有膜外翻、膜出泡、棒状或芽状突起等形态,细胞被染成橙色,核形态不规则。细胞凋亡率为32.80±4.83%。 结论:pBudCE4.1-S9K/mIL-12转染小鼠黑色素瘤细胞B16,能抑制肿瘤细胞的增殖,促进肿瘤细胞凋亡。 第三部分携带人GLS活性肽和小鼠IL-12基因的重组沙门菌的构建 目的:构建携带人GLS活性肽与小鼠IL-12基因的重组沙门菌,并鉴定该重组菌向真核细胞递呈质粒的能力。 方法:制备沙门菌感受态,以电转化的方式将pBudCE4.1-S9K/mIL-12质粒转入细菌构建重组沙门菌,抽提质粒进行PCR鉴定重组菌;并在含Zeocin抗生素的低盐LB平板上反复传代培养,鉴定沙门菌携带质粒的稳定性。以相同方法构建含pBudCE4.1,pBudCE4.1-S9K,pBudCE4.1/mIL-12质粒的重组沙门菌作为动物实验对照菌。将质粒pEGFP-C1和pEGFP-C1/S9K转入沙门菌,然后感染小鼠巨噬细胞,通过RT-PCR和细胞荧光表达观察反映重组菌向真核细胞递呈质粒的能力。用pBudCE4.1-S9K重组沙门菌感染黑色素瘤细胞B16,48h后提取细胞总RNA,用RT-PCR法扩增GLS基因条带,了解沙门菌感染黑色素瘤细胞的能力。 结果:电转化方式可将pBudCE4.1-S9K/mIL-12导入沙门菌,该重组沙门菌能在含Zeocin抗生素的低盐LB平板生长和传代,抽提质粒鉴定出与GLS基因与mIL-12基因相符的目的条带。携带质粒的重组沙门菌在Zeocin抗生素的低盐LB平板传代培养至少15代。用含pEGFP-C1/S9K的重组沙门菌感染小鼠巨噬细胞,48h后可观察到绿色荧光表达,同时用RT-PCR法也扩增出267bp左右的基因条带。含pBudCE4.1-S9K重组沙门菌感染黑色素瘤细胞B16,用RT-PCR法也扩增出267bp左右的基因条带。 结论:成功构建含pBudCE4.1-S9K/mIL-12的重组沙门菌及含pBudCE4.1,pBudCE4.1-S9K,pBudCE4.1-mIL-12质粒的重组沙门菌。携带质粒的重组沙门菌能稳定传代15代。重组沙门菌能向小鼠巨噬细胞递呈携带基因。重组沙门菌对小鼠黑色素瘤细胞有一定的感染能力。 第四部分携带GLS与IL-12真核共表达质粒重组沙门菌局部注射抗肿瘤实验 目的:建立小鼠黑色素瘤模型,观察含pBudCE4.1-S9K/mIL-12的重组沙门菌局部瘤内注射的抗瘤效果。 方法:C57BL/6J纯系小鼠于前肢右侧腋下皮下接种肿瘤细胞B16,每鼠106细胞(0.1ml细胞悬液),待肿瘤长到1cm大小时,取瘤组织病理切片HE染色确认肿瘤模型。以104/ml ,106/ml ,108/ml, 1010/ml瘤内注射0.1ml观测肿瘤生长情况,确定治疗剂量。以肿瘤接种后1,4,7,10天开始治疗,确定治疗起始时间。治疗分6组,分别用PBS,沙门菌,含pBudCE4.1 , pBudCE4.1-S9K , pBudCE4.1/mIL-12 ,pBudCE4.1-S9K/mIL-12质粒的重组沙门菌进行瘤内注射治疗,从肿瘤接种后1天开始治疗,每次0.1ml(108/ml),一周一次共4次。隔日观察肿瘤生长情况,测量肿瘤大小和观察带瘤存活期。取小鼠血清用ELISA试剂盒检测IFN-γ和IL-12的变化。取肿瘤组织行病理切片HE染色观察肿瘤病理变化。 结果:皮下接种B16细胞的C57BL/6J能形成肿瘤,病理检查可看到肿瘤组织间有大量的黑色素沉着。在104/ml ,106/ml ,108/ml重组菌治疗时肿瘤无明显的破溃,肿瘤抑制呈剂量依赖性,108/ml治疗剂量最明显。小鼠从接种肿瘤后1天开始治疗,效果最好。用含pBudCE4.1-S9K/mIL-12质粒的重组沙门菌以108/ml进行治疗,肿瘤生长受抑制,肿瘤大小明显小于同期的PBS对照组和单独的沙门菌组(p0.05);小鼠血清中的IL-12和IFN-γ升高(p0.05);肿瘤组织有坏死,细胞溶解,结构不清,可见到淋巴细胞的浸润。 结论:携带pBudCE4.1-S9K/mIL-12质粒的重组沙门菌瘤内注射对小鼠黑色素瘤有一定的治疗作用。 第五部分口服给药观察GLS与IL-12真核共表达质粒重组沙门菌体内抗肿瘤效应 目的:探讨口服给予含pBudCE4.1-S9K/mIL-12质粒的重组沙门菌对小鼠黑色素瘤的抗瘤效果。 方法:C57BL/6J纯系小鼠于前肢右侧腋下皮下接种肿瘤细胞B16,每鼠106细胞(0.1ml细胞悬液),建立小鼠黑色素瘤模型。口服pEGFP-C1重组沙门菌,48小时后,解剖取出瘤体组织,固定,切片,于荧光显微镜下观察绿色荧光表达情况了解沙门菌的肿瘤靶向性。治疗分6组,分别用PBS,沙门菌,含pBudCE4.1,pBudCE4.1-S9K,pBudCE4.1/mIL-12,pBudCE4.1-S9K/mIL-12质粒的重组沙门菌进行灌胃治疗,从接种肿瘤细胞即开始治疗,每次0.1ml(109/ml),每周一次,共4次。隔日观察肿瘤生长情况,测量肿瘤大小和带瘤存活期。取小鼠血清用ELISA试剂盒检测IFN-γ和IL-12的变化。取肿瘤组织行病理切片HE染色观察肿瘤病理变化。 结果:口服pEGFP-C1重组沙门菌48小时后,在肿瘤组织观察到绿色荧光蛋白的表达。与PBS组和沙门菌组相比,用pBudCE4.1-S9K/mIL-12重组沙门菌进行治疗,肿瘤生长受抑制,肿瘤体积较小(p0.05);小鼠血清中的IL-12和IFN-γ升高(p0.05);带瘤存活期延长;病理检测可见肿瘤组织有坏死和淋巴细胞的浸润。 结论:携带pBudCE4.1-S9K/mIL-12质粒的重组沙门菌口服治疗对小鼠黑色素瘤有一定的治疗作用。