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β_3-AR激动剂筛选模型的建立及其活性化合物筛选

曾凡新  
【摘要】: 研究背景: 糖尿病(diabetes mellitus)是由多种病因引起的代谢紊乱,其中90%以上为2型糖尿病。该病的患病率在世界范围内呈上升趋势,成为继心脑血管疾病、肿瘤之后的又一严重危害大众健康的慢性非传染性疾病。肥胖症(obesity)作为一种全身性内分泌代谢疾病,不但影响体态和活动,而且与多种疾病如高脂血症、动脉粥样硬化、冠心病、糖尿病等密切相关。肥胖是2型糖尿病的独立危险因素,而临床上90%的2型糖尿病患者伴有肥胖。因此,研究开发能同时治疗肥胖与糖尿病这两种相关性疾病的药物,具有很大经济价值和社会价值。 β3肾上腺素受体(β3-adrenoceptor,β3-AR)为β肾上腺素受体(β-adrenergic receptor,β-AR)的一种亚型,主要分布于白色和棕色脂肪细胞表面,并且对经典的β-AR拮抗剂不敏感。大量研究表明,β3-AR激动剂可通过刺激白色脂肪分解和棕色脂肪组织产热、增敏胰岛素及促进葡萄糖摄取等机制发挥对肥胖与2型糖尿病的治疗作用,因此,β3-AR是肥胖与2型糖尿病的双重治疗作用靶点。但由于人和啮齿动物的β3-AR在结构和功能上存在较大差异,只有通过建立在人β3-AR基础上的筛选模型筛选出的化合物,才能更好地预测其临床疗效与安全性。 研究目的: 本课题研究的目的旨在通过建立基于人β3-AR激动剂的分子、细胞筛选模型体系,为后续筛选高效、高选择性β3-AR激动剂创造条件。在模型成功建立的基础上,对一系列新化合物的β3-AR激动活性进行初步的筛选,以期研究开发出一种β3-AR激动剂类减肥和/或抗糖尿病新药。 研究方法: (1)通过PCR法从一携带人β3-AR基因的pENTR_ADRB3-Stop质粒中扩增出人β3-AR基因cDNA编码区全长,经酶切后将其插入pcDNA3.1(+)真核表达载体,构建一种含有人β3-AR cDNA的真核表达质粒,并将其转染HEK293细胞,以RT-PCR和免疫细胞化学分别检测其mRNA与蛋白的表达。 (2)通过免疫细胞化学、免疫荧光、Western Blotting及放射性配体结合实验,鉴定分别稳定转染有人β1-AR,β2-AR和β3-AR基因的CHO-K1细胞中三种β-AR亚型的表达。 (3)通过将pCRE-luc质粒和pRL-TK质粒瞬时共转染稳定表达人β3-AR基因的CHO-K1细胞,建立一种基于双荧光素酶报告基因检测的β3-AR激动剂筛选模型,并以异丙肾上腺素作为刺激验证该模型的可靠性。在此基础上,对一系列新合成的化合物的β3-AR激动活性进行筛选。 (4)通过免疫细胞化学方法鉴定β-AR亚型在SW872前脂肪细胞中的表达,并以油酸诱导其分化为脂肪细胞,加入地塞米松诱导,建立一种SW872脂肪细胞的胰岛素抵抗模型。 (5)通过SW872前脂肪细胞增殖分化模型、SW872脂肪细胞胰岛素抵抗模型和基于双荧光素酶报告基因检测的β3-AR激动剂筛选模型,研究了苯乙醇胺类衍生物Betaphrine的体外药理效应。 实验结果: (1)我们构建的人β3-AR真核表达质粒pcDNA3.1(+)-β3-AR经双酶切后电泳显示出现预期的条带,测序结果显示目的基因已正确插入,没有突变发生。将该质粒瞬时转染HEK293细胞,RT-PCR检测到其β3-AR mRNA的表达,免疫细胞化学方法检测到细胞中出现明显的免疫阳性反应。 (2)免疫细胞化学检测三种稳定转染有人β1-AR,β2-AR和β3-AR基因的CHO-K1细胞的结果显示,三种细胞中均出现明显的免疫阳性反应。免疫荧光检测显示,三种细胞中都有明显的荧光,荧光主要位于细胞膜和细胞浆中。提取三种细胞中的蛋白,以Western Blotting检测的结果,分别得到预期大小的目的条带。通过放射性配体结合实验检测的结果,三种细胞都可与放射性标记配体125I-Cyanopindolol (125I-CYP)特异性结合。 (3)将pCRE-luc质粒和pRL-TK质粒按10:1的比例瞬时共转染稳定表达人β3-AR基因的CHO-K1细胞后48小时,以异丙肾上腺素刺激可使该细胞的荧光素酶报告基因活性比对照组显著增强(P0.01),提示该细胞模型对β3-AR激动剂具有良好的反应性,可以用于β3-AR激动剂的筛选。以该细胞筛选模型对20种新化合物进行活性筛选,得到8个活性较强的化合物,用于进一步的研究。 (4)免疫细胞化学研究的结果显示,SW872前脂肪细胞中同时表达有β1-AR,β2-AR和β3-AR三种β-AR亚型。0.6M的油酸与该细胞作用3天,可成功将其诱导为脂肪细胞。与对照组相比,1μM地塞米松与SW872脂肪细胞作用4天,可使细胞培养液中残存葡萄糖浓度显著升高(P0.01)。PPARγ受体激动剂吡格列酮可呈浓度浓度性降低培养液中的葡萄糖浓度。 (5)苯乙醇胺类衍生物Betaphrine可呈浓度依赖性促进SW872前脂肪细胞的增殖,并降低其分化过程中的脂肪积聚。Betaphrine也可显著减轻SW872脂肪细胞的胰岛素抵抗,其作用可被普萘洛尔所抑制。Betaphrine还可显著升高荧光素酶报告基因的活性。 实验结论: (1)成功构建了人β3-AR基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)-β3-AR,并证实其可在真核细胞内正常表达。 (2)稳定转染有人β1-AR,β2-AR和β3-AR基因的CHO-K1细胞均表达有各自的受体蛋白,可以用于高效高选择性β3-AR激动剂的筛选。 (3)基于双荧光素酶报告基因检测的β3-AR激动剂筛选模型对激动剂保持良好的反应性,表明该模型是可靠有效的,可以用于β3-AR激动剂的筛选。 (4)通过地塞米松诱导,成功建立了一种SW872脂肪细胞的胰岛素抵抗模型。 (5)苯乙醇胺类衍生物Betaphrine具有显著的β3-AR激动活性,可通过促进脂肪分解,改善胰岛素抵抗等发挥抗肥胖和抗糖尿病作用,因而可能成为肥胖与2型糖尿病的治疗新药。


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