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神经球蛋白对脑缺血中神经细胞保护作用的实验研究

朱继  
【摘要】: 缺血性脑血管疾病是中老年人的常见病、多发病,亦是导致老年人死亡和致残的主要疾病。由于其发病机制复杂,病因学尚未完全清楚,至今仍没理想的根治或逆转的药物。氧是机体新陈代谢和维持生存的必要因素。到目前为止,脊椎动物中发现有4种球蛋白:它们分别是参与氧储存与转运的血红蛋白(hemoglobin,HGB),协助氧进入线粒体的肌红蛋白(myoglobin,MGB),充当氧缓冲剂、便于氧扩散和参与清除细胞毒性分子-NO的细胞球蛋白(cytoglobin)以及新近发现的神经球蛋白(neuroglobin,NGB)。NGB是一种脊椎动物单体球蛋白,已被证明具有储存、转运氧气和保护神经细胞的功能,并能增强氧气扩散进入线粒体的能力,对神经细胞具有保护功能。在本研究中,通过克隆得到了NGB的基因表达序列,构建其真核表达载体,并成功建立了大鼠局灶性脑缺血模型。在此基础上,进一步探讨重组质粒pCDNA3.1(+)/Ngb对大鼠脑缺血的神经保护作用。 一、大鼠神经球蛋白基因的克隆及载体构建 (一)大鼠神经球蛋白基因的克隆与序列分析 从雄性Wistar大鼠脑组织中提取总RNA,经逆转录PCR得到cDNA,测序并利用BLAST工具对比证明该基因序列正确。结果:克隆了Wistar大鼠的神经球蛋白基因,有4个碱基发生了突变。结论:Wistar大鼠脑组织中有神经球蛋白表达,获得了神经球蛋白基因的表达序列,为以后的研究提供了重要的实验材料。 (二)大鼠神经球蛋白基因的真核表达载体构建将得到的神经球蛋白基因序列亚克隆入pCDNA3.1(+)载体中,并通过双酶切和测序确定序列和阅读框正确。结果:酶切片段和测序表明插入片段序列正确。结论:成功构建了神经球蛋白真核表达载体。 (三)大鼠神经球蛋白的原核表达及多克隆抗体制备将神经球蛋白基因序列亚克隆入pET-28a(+)载体中,通过双酶切和测序确定序列和阅读框正确。转化大肠杆菌BL21菌株,获得可溶性表达产物,经鉴定、纯化后免疫新西兰兔,分离血清,ELISA法测定抗体效价。结果:神经球蛋白多克隆抗体效价达1∶100000。结论:成功制备了兔抗神经球蛋白的多抗,为以后的研究提供了重要的实验材料。 二、大鼠局灶性脑缺血模型的建立 40只雄性Wistar大鼠随机分为常规线栓组和改良线栓组,每组20只。线栓法制备右侧大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion MCAO)致局灶性脑缺血模型。观察改良线栓对总体手术时间、术中颈总动脉血流阻断时间、线栓误入翼腭动脉(pterygopalatine artery,PPA )几率(PPA误栓率)和模型成功率的影响,并通过神经行为学评分、氯化四氮唑(TTC)染色和磁共振检测等方法评价该模型的稳定性和可靠性。结果:改良线栓组比常规线栓组明显缩短了总体手术时间和术中颈总动脉血流阻断时间,降低了线栓误入PPA的几率,模型成功率高,稳定可靠。结论:改良线栓可增加模型成功率,提高局灶脑缺血模型的稳定性和可靠性。 三、重组质粒pCDNA3.1(+)/Ngb对大鼠脑缺血神经细胞保护作用的研究 54只雄性大鼠随机分为生理盐水组、空质粒组和重组质粒pCDNA3.1(+)/Ngb组,每组18只,分别在皮质区两部位注射生理盐水、空质粒pCDNA3.1(+)和重组质粒pCDNA3.1(+)/Ngb,并在注射后24h采用改良线栓法制备大鼠大脑中动脉缺血24h模型。采用TTC染色、原位细胞凋亡检测、间接免疫荧光法和Western blot检测各组大鼠脑梗死面积,神经细胞凋亡状况和bcl-2蛋白表达变化。结果:经重组质粒pCDNA3.1(+)/ Ngb处理的大鼠,其脑梗死面积和注射处缺血半暗带凋亡细胞数较其他两组显著减少(P0.01),注射处缺血半暗带bcl-2阳性细胞面积百分比显著提高(P0.01),bcl-2蛋白的表达上升约40%~50%。结论:质粒pCDNA3.1(+)介导大鼠神经球蛋白基因转入脑内可通过上调bcl-2基因表达抑制局灶性脑缺血神经细胞凋亡,对局灶性脑缺血发挥保护作用。


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