黄连生物碱抗结肠癌作用实验及其分子机制研究

【摘要】： 目的: 观察黄连总碱和小檗碱对结肠癌的防治作用,并探讨其可能的作用机制。 方法: 1.采用1-2 dimethylhydrazine (DMH)皮下注射(sc)+ 1%的dextran sodium sulfate(DSS)水溶液饮用诱导形成大鼠结肠癌模型。实验分6组:(1).模型组(DMH 40 mg/kg + DSS;(2).美洛昔康小剂量组(DMH+DSS+0.45 mg/kg);(3).美洛昔康大剂量组(DMH+DSS+1.35 mg/kg);(4).黄连总碱小剂量组(DMH+DSS+120 mg/kg);(5).黄连总碱大剂量组(DMH+DSS+360 mg/kg);(6).小檗碱组(DMH+DSS+100mg/kg)。每组各25只大鼠。观察各组药物对诱瘤后第10 wk大鼠结肠ACF数量、第20 wk对大鼠结肠癌的发生率及体重变化的影响。应用美蓝染色法观察ACF数量,HE染色法进行形态学观察和病理定性分析。 2.培养人结肠癌lovo细胞,给予不同浓度黄连总碱、小檗碱、美洛昔康和罗格列酮(10-6mol/l、10-5mol/l、10-4mol/l、10-3mol/l),作用细胞6 h、12 h和24 h后,应用四甲基谷氮蓝实验(MTT)观察对lovo细胞增殖的影响。 3.培养人结肠癌lovo细胞,给予小檗碱(10-5 mol/l) +或不+ GW9662(10-7 mol/l)和罗格列酮(10-5 mol/l)+或不+ GW9662(10-7mol/l)分别作用24h后,应用MTT法观察对lovo细胞增殖的影响。 4.采用逆转录聚合酶链反应(Reverse transcription ploymerse chain reaction,RT-PCR)检测各用药组细胞COX-2、PPARγmRNA表达水平。 5.采用蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测各用药组细胞COX-2、PPARγ蛋白表达水平。 结果: 1.黄连生物碱对DMH+DSS处理大鼠生长发育的影响黄连生物碱可以明显改善DMH+DSS诱癌过程中大鼠的恶液质状态,阻断体重减轻。 2.黄连生物碱对DMH+DSS诱导大鼠ACF的影响实验第10 wk,模型组大鼠诱导出ACF19.2±3.5,数量明显高于各药物干预组。黄连总碱大、小剂量组对ACF的形成呈现出剂量依赖性抑制(P0.05);与黄连总碱小剂量相当的小檗碱组ACF平均数量明显低于模型组(P0.01);阳性对照美洛昔康大、小剂量组对ACF的形成也呈现出剂量依赖性抑制(P0.05);黄连大剂量组、美洛昔康大剂量组和小檗碱组组间比较ACF形成数量没有明显差异。 3.黄连生物碱对DMH+DSS诱导大鼠结肠癌的影响实验第20wk,模型组结肠癌发生率为80%,明显高于各药物干预组(P0.01);黄连总碱大小剂量组的诱癌率分别为33.3%、25%;与黄连总碱小剂量组相当的小檗碱组诱癌率与其相同为33.3%;阳性对照美洛昔康大小剂量组的诱癌率分别为40%、26.7%。组间比较无明显差异。 4.黄连生物碱对lovo细胞增殖的抑制作用及其与PPARγ、COX-2的关系 黄连总碱、小檗碱在浓度大于10-5mol/l,阳性对照药物罗格列酮在浓度大于10-5mol/l、美洛昔康在浓度大于10-4mol/l明显抑制lovo细胞增殖,诱导凋亡,且呈浓度和时间依赖性。黄连总碱、小檗碱、美洛昔康和罗格列酮对lovo细胞作用24 h IC50分别为3.21±0.1μmol/l、2.83±0.2μmol/l、4.99±0.17μmol/l和3.14±0.135μmol/l。 PPARγ特异性阻断剂GW9662预处理细胞后,罗格列酮对细胞的抑制作用明显减弱(P0.01),但是对小檗碱诱导细胞凋亡的作用没有影响。小檗碱和罗格列酮能浓度依赖性地降低lovo细胞中COX-2和PPARγmNRA表达,对COX-2蛋白表达也呈浓度依赖性抑制,但是对PPARγ蛋白表达没有显著影响。PPARγ特异性阻断剂GW9662预处理细胞后,逆转了罗格列酮对COX-2 mRNA和蛋白的抑制表达作用。 结论: 1.黄连生物碱能抑制大鼠诱癌早期ACF的形成和肿瘤发生率。对DMH+DSS诱导的大鼠结肠癌有明显的化学预防作用。 2.黄连生物碱能抑制人结肠癌lovo细胞增殖,诱导凋亡。与小檗碱和阳性药物比较黄连总碱作用最为明显,这可能与黄连总碱中含有其他生物碱有关。 3.PPARγ特异性阻断剂GW9662不能逆转小檗碱诱导lovo细胞凋亡的作用,提示小檗碱的抗肿瘤作用可能与PPARγ路径无关。 4.小檗碱能抑制lovo细胞中COX-2 mRNA、蛋白和PPARγmRNA的表达, GW9662不能阻断小檗碱对细胞中COX-2表达的影响,提示小檗碱的抗结肠癌作用中可能与通过非PPARγ路径调节COX-2表达有关,但具体机制待于深入研究。