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聚焦超声辐照豚鼠慢性湿疹模型的实验研究

祝青  
【摘要】: 背景 慢性湿疹为临床上常见的皮肤病,因其慢性、复发性和瘙痒性而影响患者的生活质量,目前却无理想的治疗方法。超声治疗是近年来发展很快的微创治疗技术,已广泛应用于多种良恶性疾病的治疗,取得了良好的治疗效果。特别是治疗外阴白色病变疗效显著,现已大量应用于临床治疗。而大部分外阴白色病变在病因、临床表现及病理改变与慢性湿疹有许多相似之处。能否将超声运用于慢性湿疹的治疗是超声治疗皮肤疾病的重要研究方向之一。 目的 本实验用2,4-二硝基氯苯(DNCB)制备豚鼠慢性湿疹模型来观察聚焦超声对慢性湿疹的有效性和安全性,特别是超声对慢性湿疹动物模型皮肤淋巴细胞凋亡及凋亡调控蛋白表达的影响,细胞因子IL-4、IL-12和IFN-γ在超声辐照前后表达变化及神经生长因子NGF和神经肽SP的表达变化。旨在探讨超声用于治疗慢性湿疹的可行性及其可能机制,为临床提供一种新的有效的安全的治疗慢性湿疹的物理治疗方法奠定理论基础。 方法 本研究分为5个部分:1.将20只豚鼠随机分为4组,以4W、3W、2W、1W不同的功率和4mm/s的速度直线扫描背部去毛处,每处扫描时间为60s。超声辐照后即刻、6天、15天观察辐照区域皮肤变化情况与动物精神、饮食及大小便情况。并同时做皮肤活检,HE染色病理组织学检查。旨在选择能够对豚鼠皮肤产生治疗效应又不引起凝固性坏死的剂量,为下一步超声辐照慢性湿疹豚鼠模型奠定剂量学基础。2.选择健康豚鼠40只,每只背部剃毛2处,应用2,4 -二硝基氯苯为抗原,小剂量多次刺激豚鼠皮肤制备慢性湿疹模型。将模型随机分为1W组和2W组,每组20只,自身空白对照,每只豚鼠一侧超声辐照,另一侧空照。根据形态学和组织病理学观察进行疗效评估。初步观察聚焦超声对豚鼠慢性湿疹模型的有效性和安全性。3.超声辐照后在24h、48 h采用TUNEL法和SP免疫组化法观察2W组、1W组和对照组细胞凋亡及Bcl-2和Bax蛋白表达情况。探讨聚焦超声诱导慢性湿疹模型豚鼠皮肤淋巴细胞凋亡的作用及其机制。4.超声辐照前,正常组和建模组取皮肤活检,超声辐照后14天,辐照组和对照组取皮肤活检,用SP免疫组化法观察细胞因子IL-4、IL-12和IFN-γ的表达变化,探讨IL-4、IL-12和IFN-γ在慢性湿疹发病机制中的可能作用及超声治疗慢性湿疹的可能机制。5.超声辐照前,正常组和建模组取皮肤活检,超声辐照后14天,辐照组和对照组取皮肤活检。用SP免疫组化法观察NGF和SP的表达变化,探讨NGF和SP在慢性湿疹发病中的可能作用及聚焦超声治疗慢性湿疹的可能机制。 结果 1.大体观察:超声辐照后豚鼠皮肤即出现红肿,皮温增高,随剂量的增加充血水肿变明显。1 W和2 W组为散在点状水疱,3 W和4W组水疱融合成片。6天后,充血水肿消失。3 W和4W组有红褐色或黄褐色厚痂生成,1 W和2 W组见少量薄痂和鳞屑。辐照15天后,3 W和4W组有瘢痕生成,瘢痕处未见毛发。1 W和2 W组皮肤外观正常,未见瘢痕,毛发生长浓密。组织学:辐照后,表皮内水疱,真皮乳头层充血水肿,随剂量的增加水疱及充血水肿变明显。6天后,充血水肿消失,表皮增厚,真皮乳头层淋巴细胞浸润。3 W和4W组有厚痂生成,真皮可见肉芽组织生成。辐照15天后,3 W和4W组皮肤毛囊减少,真皮胶原纤维增生。1 W和2 W组皮肤组织病理结构基本恢复正常。 2.建模豚鼠皮肤显示慢性湿疹样皮损特点,组织病理呈慢性湿疹样改变。超声辐照后1周,辐照组的总分明显降低,与对照组比较差异有统计学意义(P0.05)。并且2W组的疗效指数高于1W组的疗效指数。7天后病理组织切片可见辐照组表皮细胞减至4~5层,棘层肥厚减轻,表皮细胞间水肿减少,真皮内淋巴细胞和组织细胞浸润减少,真皮小血管扩张充血减轻,2W组的炎症改善较1W组更明显,而且真皮内均未见肉芽组织生成。对照组病理组织切片与7天前比较改变不明显。 3.辐照组的皮肤淋巴细胞凋亡率和Bax蛋白表达高于对照组(P0.001),2 W组高于1W组(P0.05),48 h高于24 h(P0.01)。辐照组Bcl-2蛋白表达低于对照组(P0.001)。Bcl-2蛋白表达与凋亡细胞率呈负相关(P 0.05),Bax与凋亡细胞率呈正相关(P0.01)。 4.正常组IL-4、IL-12、IFN-γ蛋白主要表达于表皮中上层,阳性染色浅黄色至棕黄色。建模组,皮损中IL-4、IL-12、IFN-γ蛋白表达于表皮全层,阳性染色呈棕黄色至棕褐色。建模组与正常组染色强度比较差异有统计学意义(P 0.01)。超声辐照后14天,辐照组IL-4表皮角质形成细胞阳性染色变淡,而对照组无明显改变,辐照组与对照组及辐照前比较差异有统计学意义(P 0.01)。IL-12、IFN-γ蛋白在超声辐照后14天,辐照组和对照组阳性表达均较辐照前增强,但辐照组IL-12、IFN-γ蛋白阳性表达低于对照组,辐照组和对照组比较有统计学意义(P 0.05)。 5.正常组NGF和SP主要表达于表皮中上层,阳性染色浅黄色至棕黄色。建模组,皮损中NGF和SP表达于表皮全层,阳性染色呈棕黄色至棕褐色,明显高于正常组。建模组与正常组染色强度差异有统计学意义(P 0.01)。超声辐照后14天,辐照组NGF和SP表皮角质形成细胞阳性染色变淡,而对照组无明显改变,辐照组与对照组差异比较有统计学意义(P 0.001)。NGF和SP二者阳性表达呈正相关(P 0.05)。 结论 1. 3W和4W的辐照剂量偏大,易造成豚鼠皮肤不可逆损伤,而1W和2W的辐照剂量是安全而且有效的,可以为下一步超声辐照慢性湿疹动物模型的辐照剂量。 2.聚焦超声辐照豚鼠慢性湿疹模型能有效地降低症状评分,初步结果显示是安全的,因此聚焦超声辐照对慢性湿疹有治疗作用,在安全的前提下,超声辐照剂量越大,治疗效果越好。 3.聚焦超声辐照豚鼠慢性湿疹模型可提高淋巴细胞Bax的表达,抑制Bcl-2的表达,进而促进豚鼠慢性湿疹模型皮肤淋巴细胞凋亡。 4.在慢性湿疹豚鼠模型中,存在细胞因子的双重表达模式,急性期皮损表皮IL-4呈优势表达,慢性期皮损表皮IL-12和IFN-γ呈优势表达。超声辐照豚鼠皮肤对平衡表皮角质形成细胞细胞因子的表达有一定作用。 5.在慢性湿疹豚鼠模型中,表皮角质形成细胞NGF和SP表达增强。影响NGF和SP表皮角质形成细胞的分泌和表达可能是聚焦超声治疗慢性湿疹的机制之一。


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