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体外模拟心肌微环境下胚胎干细胞向心肌样细胞分化的实验研究

李卫东  
【摘要】: 目的:探讨完整成熟心肌细胞或心肌细胞裂解物对胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)定向分化为心肌细胞的诱导作用及强度。 方法:收集昆明小鼠3.5d和4d胚龄的囊胚,分别将其培养在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上,4~5d后取隆起生长的内细胞团分离后再培养,观察集落的生长情况并通过碱性磷酸酶染色、OCT-4染色等对细胞集落进行鉴定。然后取3~4代ESCs,先将ESCs悬浮培养2~3d形成拟胚体(embryoid bodies,EBs),再用大鼠心肌细胞等诱导因素对其诱导培养。共分5组进行定向诱导实验,即心肌细胞诱导组、心肌细胞条件培养液诱导组、心肌细胞裂解液诱导组、胚胎干细胞分化培养液诱导组和对照组。ESCs分化为心肌细胞的结果判断,用相差显微镜观察EBs搏动情况,用免疫细胞荧光技术检测心肌细胞特异性肌钙蛋白T(TnT)、а-肌动蛋白(а-Actin)的表达。 结果:①采用0.1%胰蛋白酶-0.02%EDTA室温作用2-4分钟并辅以机械作用,分离克隆ESCs效果较好。②心肌细胞诱导组:诱导分化培养第3天起有EBs自发性、有节律跳动,12d时有93%的EBs出现节律性收缩。已分化的ESCs特异性肌钙蛋白T、а-Actin阳性表达率56.5±13.44%,显著高于其它各组(P0.05)。③心肌细胞条件培养液诱导组:12d时有8%的EBs出现节律性收缩。已分化的ESCs肌钙蛋白T、а-Actin阳性表达率5.2±2.01%,显著低于心肌细胞诱导组(P0.05),与对照组比较差异无显著性(P0.05)。④心肌细胞裂解液诱导组:12d时有36%的EBs出现节律性收缩。已分化的ESCs特异性肌钙蛋白T、а-Actin阳性表达率8.2±2.45%,显著低于心肌细胞诱导组(P0.05),显著高于对照组(P0.05)。⑤胚胎干细胞分化培养液诱导组:12d时有7%的EBs出现节律性收缩。已分化的ESCs特异性肌钙蛋白T、а-Actin阳性表达率5.08±1.38%,显著低于心肌细胞诱导组(P0.05),与对照组比较差异无显著性(P0.05)。 结论:①采用4d胚龄的囊胚和0.1%胰蛋白酶-0.02%EDTA室温作用2-4分钟并辅以机械作用的消化方法有助于提高昆明小鼠ES细胞建株能力。②心肌细胞和心肌细胞裂解液均可诱导ESCs向心肌细胞定向分化,且心肌细胞的诱导作用强于心肌细胞裂解液。


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