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缺氧性脑损伤致痫性发作机制的实验研究

陈秀  
【摘要】: 第一部分缺氧性脑损伤致痫性发作及其敏感性改变机制研究 第一节大鼠缺氧性脑损伤模型建立和评价 目的:大鼠缺氧性脑损伤(Hypoxic brain injury)模型建立和评价,为脑缺氧损伤相关病理生理机制研究提供实验基础。 方法:采用成年雄性SD大鼠,以8%氮氧混合气体缺氧后,观察其行为学、脑电图改变,并将脑组织行Nissle染色和电镜检测取材,采用光镜和透射电镜(Transmission electron microscope,TEM)观察皮层和海马病理学变化。 结果:缺氧组大鼠出现明显易激惹,不易抓取;脑电图呈现不同形式慢波,偶有痫性放电;Nissle染色显示神经元胞浆浓缩深染,排列紊乱稀疏,细胞体突起减少;TEM显示神经元不规则,异染色质增多,核周间隙明显扩大,线粒体肿胀,空泡变性,嵴模糊不清,粗面内质网及核糖体减少。 结论:采用氮氧混合气体对大鼠进行缺氧,建立缺氧性脑损伤模型,该模型可模拟缺氧性脑病后脑损害病理过程,为缺氧性脑病所致脑损伤及其相关病理生理机制研究提供动物模型。 第二节缺氧性脑损伤致大鼠亚临床痫性发作及海马苔藓纤维出芽 目的:观察缺氧性脑损伤后亚临床痫性发作及其与海马苔藓纤维出芽(Mossy fiber sprouting,MFS)和胶质原纤维酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein,GFAP)关系,探讨缺氧性脑损伤致痫性发作相关病理机制 方法:成年雄性SD大鼠随机分为对照组(Control)(n=12)与缺氧组(Hypoxia)(n=91),经8%氧氮混合气体缺氧,依据大鼠脑电活动变化,再将缺氧大鼠分成亚临床痫性发作组(Subclinical seizures)与非亚临床痫性发作组(Non-subclinical seizures),并分别用Nissle染色、Timm染色、免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)和免疫蛋白印记(Western blot)等方法观察皮层、海马神经病理学改变,海马MFS以及海马,皮层GFAP表达。 结果:缺氧损伤后部分大鼠出现尖波、尖慢波和棘波,痫样放电发生率为23.08%(21/91)。较非亚临床痫性发作组和对照组,亚临床痫性发作组CA1、CA3区、颞叶皮质神经元脱失明显(P0.05);该组缺氧后7d海马CA3区下锥体细胞层棕黑色颗粒增多,14d呈束状、斑片状颗粒沉积,28d呈现颗粒沉积条带,其CA3区MFS评分明显高于非亚临床痫性发作组和对照组(P0.05),而三组齿状回(Dentate gyrus,DG)内分子层MFS评分差异无统计学意义(P0.05);亚临床痫性发作组GFAP表达明显增强,以海马为著,与非亚临床痫性发作组比较,差异有显著性(P0.05)。 结论:缺氧损伤可致大鼠痫样放电,且痫样放电大鼠出现明显神经元丢失、海马CA3区形成MFS以及脑内GFAP表达增加,此病理变化可能与缺氧性脑损伤后亚临床痫性发作有关。 第三节缺氧性脑损伤致大鼠痫性发作敏感性和脑内PSD-95、VGluT1、VGluT 2表达改变 目的:观察缺氧性脑损伤大鼠痫性发作敏感性,及其突触后致密物质-95(Postsynaptic density-95,PSD-95),囊泡膜谷氨酸转运载体-1,-2(Vesicular glutamate transporter subtype 1,subtype 2,VGluT1,VGluT 2)免疫反应改变以及相关脑区神经元丢失。探讨缺氧性脑损伤致痫性发作敏感性改变的病理机制。 方法:成年雄性SD大鼠随机分为对照组(Control)(n=35)和缺氧组(Hypoxia)(n=35),以8%氧氮混合气体建立大鼠缺氧性脑损伤模型。两组各取大鼠(n=10)腹腔注射戊四唑( pentylenetetrazol PTZ)10mg/kg.5min检测致痫性发作阈值;两组再各取大鼠(n=15)腹腔注射PTZ 35mg/kg.2d,连续20d,进行大鼠点燃,检测癫痫点燃大鼠数目和痫性发作程度,两组动物中经PTZ点燃大鼠分别纳入单纯点燃组(Simple kindling)和缺氧后点燃组(Post-hypoxic kindling)。对照组和缺氧组剩余大鼠(n=10)与单纯点燃组和缺氧后点燃组大鼠分别采用IHC和Western blot等方法观察大鼠颞叶皮层、海马和中脑神经元脱失以及脑内PSD-95,VGluT1,VGluT 2免疫反应改变。 结果:①与对照组相比,缺氧组诱导痫性发作PTZ剂量降低,且痫性发作潜伏期缩短;同时,经PTZ点燃大鼠数目明显增多,其痫性发作程度更严重(P0.05)。②缺氧组颞叶皮层、中脑和CA1区神经元数目明显低于对照组;缺氧后点燃组颞叶皮层和CA1区较其他各组神经元丢失显著(P0.05)。③缺氧组皮层、海马PSD-95免疫阳性细胞数和免疫印迹光密度值(0ptical density,OD)低于其他三组(P0.05)。④缺氧组颞叶皮层和海马区VGluT1免疫阳性细胞OD明显高于对照组;而缺氧后点燃组颞叶皮层和海马区VGluT1免疫阳性细胞OD较缺氧组和单纯点燃组明显增加(P0.05)。⑤缺氧后点燃组VGluT1免疫印迹OD高于其他三组;缺氧组VGluT1免疫印迹OD值高于对照组(P0.05)。⑥各组海马与中脑VGluT2免疫阳性细胞与免疫印迹OD无差异(P0.05)。 结论: VGluT1免疫反应性增加,脑内PSD-95表达降低,相关脑区神经元显著丢失。上述病理变化可导致痫性发作敏感性增加和脑内兴奋性增高,对缺氧脑损伤致痫性发作敏感性改变产生重要作用。 第二部分缺氧诱导海马神经元兴奋性与痫性发作改变研究 第一节无血清原代培养大鼠海马神经元方法建立 目的:建立大鼠海马神经元无血清原代培养方法,检测培养神经元电生理特性,为体外研究提供实验基础。 方法:钝性分离新生SD大鼠双侧海马,经酶消化及吸管吹打,采用添加B27的无血清培养基培养原代海马神经元,动态观察其形态学变化;通过免疫细胞化学检测神经丝(NF-200)和神经元特异核蛋白(Neu-N)染色鉴定神经元;将培养至第8-14d神经元,采用膜片钳全细胞记录模式,检测其电生理特性。 结果:培养的海马神经元可体外存活20d以上,8-14d细胞胞体呈锥形或三角形、表面光洁、折光性好、突起多而明显,形成神经网络。电生理记录显示:状态良好的神经细胞易于封接形成全细胞记录且能维持较长时间,其封接成功率80%;平均静息膜电位(RMP)为-57.7±9.2mV;电压钳下(钳制电位从-60mV~+60mV,step=l0mV,时长30ms)显示典型内向钠电流和外向钾电流;电流钳下跃阶恒流刺激(-60pA~+40pA,step=10pA,时长200ms),大部分所记录的神经元产生动作电位,阈值43.1371±5.3245 mV,时程8.3571±3.1407ms ,动作电位幅度83.05±9.79mV。 结论:采用大鼠海马神经元无血清原代培养方法,可在体外获得状态良好的海马神经元,且适用于膜片钳记录,并显示出正常神经元电生理特性。 第二节不同缺氧持续时间诱导海马神经元兴奋性改变 目的:探讨不同缺氧持续时间对海马神经元兴奋性相关电生理特性的影响。 方法:原代培养海马神经元经(95% N2 / 5% CO2)混合气饱和人工脑脊液(Artificial cerebrospinal fluid,ACSF)灌流缺氧,选取灌流5、10、15、20、25、30、35、40min后8个时段,采用全细胞记录模式测定不同时段神经细胞膜电位,电流钳下跃阶电流(-60pA~+40pA,step=10pA,时长200ms)刺激,测定不同时段神经细胞阈强度,即诱发神经元产生动作电位的最低电流强度。对照组神经元灌流(95% O2 / 5% CO2)混合气饱和ACSF. 结果:持续缺氧10、15min后神经细胞膜电位值升高,较对照组神经细胞膜电位有差异(P0.05);而持续缺氧25、30、35、40min后神经细胞膜电位值低于对照组膜电位(P0.05)。神经细胞持续缺氧10、15min后,其阈强度高于对照组(P0.05);而持续缺氧25、30、35、40min后神经细胞阈强度低于对照组(P0.05)。 结论:缺氧早期神经细胞膜电位呈现超极化,阈强度增高,兴奋性降低;随缺氧程度加剧,神经细胞膜电位呈现去极化,阈强度减低,兴奋性增高。 第三节急性缺氧对谷氨酸诱导海马神经元痫性放电的影响 目的:探讨急性缺氧对谷氨酸诱导海马神经元痫性放电的影响。 方法:经(95% N2/ 5% CO2)混合气饱和ACSF进行灌流原代培养海马神经细胞30min建立急性细胞缺氧模型,采用全细胞模式记录缺氧前(Pre-hypoxia)、缺氧(Hypoxia)、缺氧后10、20、30、40min(Post-hypoxic 10、20、30、40min)神经细胞膜电位,膜电容及膜入路阻抗,以确定缺氧对神经细胞膜电生理特性的影响;在电流钳下,采样程序为Gap-free模式,测定对照组(Control)、缺氧组(Hypoxia)、谷氨酸组(Glutanate)和缺氧+谷氨酸组(Hypoxia+glutamate)海马神经细胞自发动作电位,分析其放电频率;再采用相同记录模式,给予对照组与缺氧组海马神经细胞灌流2.5μmol/L谷氨酸10min,测定能否诱发出动作电位。对照组神经元灌流(95% O2 / 5% CO2)混合气饱和ACSF。 结果:缺氧、缺氧后10、20、30、40min神经细胞膜电位值显著低于缺氧前(P0.05),缺氧后10、20、30、40min细胞膜电位无显著性差异(P0.05)。膜电容出现与膜电位相似变化趋势,而膜入路阻抗与细胞膜电位、膜电容变化相反。各组动作电位频率(3Hz)分布有显著差异(P0.05),缺氧组大于3Hz的自发性动作电位百分率显著高于对照组,缺氧+谷氨酸组大于3Hz的自发性动作电位百分率高于其他各组。灌流2.5μmol/L谷氨酸10min后,缺氧组细胞诱发出可逆性去极化和连续出现动作电位,而对照组细胞仅诱发出可逆性去极化。 结论:缺氧可致神经细胞膜电生理特性改变以及自发放电频率增加,此可能减低痫样活动阈值。缺氧还致神经元痫性放电敏感性增加。


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