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H-FABP死后诊断早期心肌梗死的免疫组化实验性研究

郭淼  
【摘要】: 背景: SCD的研究是法医病理学重要的任务之一,而AMI的死后诊断是法医病理学的重点和难点。不足6h的心肌梗死死亡病例,其心肌在肉眼和光学显微镜下无特异性的改变,不使用特殊方法,难以对AMI引起的猝死作出早期的组织学诊断。在常规的组织学染色出现特征性的形态学改变以前,缺血心肌已经发生了一系列的病理生理变化。生物化学,组织化学、酶组织化学、荧光组织化学染色,电子显微镜技术都能显示心肌的早期损害,但是上述方法因操作过于复杂,缺乏特异性、稳定性,费用过高,以及易受到组织自溶、腐败等因素的影响而限制了它们在法医学中的应用。IHC作为一项快捷、简便、实用的方法,它可以显示缺血心肌细胞内蛋白质质和量的变化,从而为AMI死后诊断提供了一种可能。心脏型脂肪酸结合蛋白是一种小分子蛋白质((14一15kDa),且有严格的器官特异性,大量地存在于心肌细胞浆中,其作用是上调心肌细胞中的长链脂肪酸。具有分子量小、心肌细胞中含量高且为水溶性的特点,当心肌细胞缺血时,心脏型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)很容易迅速地透过细胞膜而漏出到细胞间质,从而进入血液循环。大量的临床研究证实心肌缺血12小时内,用血液中脂肪酸结合蛋白的浓度诊断心肌梗死在特异性和敏感性方面都优于肌红蛋白,原因主要是脂肪酸结合蛋白的分子量较肌红蛋白(18kDa)小且有心脏特异性。因此心肌脂肪酸结合蛋白目前被世界卫生组织列为新推荐的诊断急性心肌梗死的早期指标之一。用于心肌缺血引起猝死的死后诊断的IHC指标能否用于法医病理学诊断,需要考虑其特异性和敏感性以外,还必须考虑组织自溶、腐败等因素对抗原的影响。因此用于心肌缺血引起猝死的死后诊断的各种IHC指标的死后稳定性及其在死后不同时间的表达变化规律是值得进一步研究。 目的:本研究利用结扎左侧冠状动脉前降支的方法建立动物心肌缺血模型,运用免疫组化的方法,探讨H-FABP在死后诊断早期心肌梗死的敏感性及死后稳定性,以期对其在法医学中诊断SCD的应用价值进行评价。 实验分为两部分: 一. H-FABP在缺血心肌中的表达及敏感性研究 方法:结扎大鼠左侧冠状动脉前降支的方法建立大鼠心肌缺血模型,检测H-FABP在大鼠心肌缺血不同时间的表达。45只健康SD大白鼠,重250-300克,雌雄不限,随机分为8个实验组和1个对照组,每组5只。对照组大白鼠除不结扎冠状动脉外,其它步骤与实验组完全相同。各实验组大白鼠分别于结扎后15分钟、30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、6小时、8小时后处死,对照组大白鼠于手术后0小时处死.取出心脏放入10%中性缓冲福尔马林液中固定24h。取材后作HE染色和H-FABP免疫组织化学染色,显微镜下观察两组标本的HE、IHC切片;并按IHC染色结果判定标准对IHC染色进行全面的观察、判断,采用图像分析技术,客观测量IHC切片中H-FABP的缺失面积和阳性面积。 结果: 1.常规HE染色:对照组及心肌缺血3h以内组,心肌细胞染色清晰、边界清楚、横纹存在,仅见有轻度心肌间质水肿。心肌缺血4h后缺血区可见少许心肌细胞轻度水肿,缺血区边缘有少许炎性细胞浸润、心肌嗜伊红性增强,未见明显的细胞坏死。心肌缺血8h可见心肌嗜伊红性明显增强,部分心肌细胞出现凝固性坏死,炎性细胞增多。 2.免疫组织化学染色:对照组心肌胞浆全部染成均匀的棕黄色,用苏木素衬染后,细胞核染成淡蓝色,心肌细胞间质及其他细胞成分不着色。实验组心肌细胞H-FABP在缺血心肌内的脱失表达具有明显的时间规律。缺血15分钟组,在心内膜下心肌、乳头肌可见散在或小灶性的部分H-FABP缺失。缺血30分钟组,开始出现脂肪酸结合蛋白的完全脱失,但仍然局限于心肌内膜下和乳头肌。缺血1小时和2小时组的心肌则出现斑片状缺失且波及到心肌中层,缺血3小时累及心肌外层。缺血4小时,心肌细胞则出现全层细胞的完全脱失并随着缺血时间的延长,脱失面积增大。H-FABP在心肌缺血不同时间的各组缺失面积经比较和统计学分析表明:实验组的H-FABP缺失面积与其各相应对照组比较均有显著性差异,H-FABP在缺血3小时内各组之间没有明显的差异性,而心肌缺血3小时与心肌缺血4小时的心肌细胞中H-FABP脱失面积仍有显著差异,说明H-FABP的敏感性主要体现在心肌缺血3h以前。 二. H-FABP在诊断早期心肌梗死的死后稳定性的实验性研究 方法:结扎左侧冠状动脉前降支的方法建立家兔心肌梗死3小时模型,检测H-FABP在死后不同时间的表达情况。20只健康新西兰大白兔,体重2-2.5kg,雌雄不限,随机分为实验组(B组n=10)和对照组(A组n=10)。实验组予以结扎左冠状动脉前降支造成心肌缺血持续3小时后断颈处死,取缺血区心肌;对照组除不结扎冠状动脉外,其它步骤与实验组完全相同。术后0时直接处死,取左心室心肌。两组标本在4℃放置,分别于死后1h、2h、4h、8h、16h、1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d、10d、2w、取材作HE染色和H-FABP免疫组化染色。观察两组标本的HE切片;并按IHC染色结果判定标准对IHC染色进行全面的观察、判断,采用图像分析技术,客观测量IHC切片中H-FABP的缺失面积和阳性表达强度。 结果: 1.常规HE染色:缺血心肌组织可见细胞浊肿、水样变,横纹模糊或消失,胞浆灶性嗜伊红性增强、胞核缩小而染色加深,心肌纤维波浪样改变等心肌早期缺血的病理改变,未见典型心肌梗死改变。缺血心肌4℃放置3-4天,心肌结构部分改变如心肌细胞浊肿、横纹模糊或消失与正常心肌死后变化相似,缺乏特异性。放置7-14天,缺血心肌组织和细胞形态与对照组类似。 2.免疫组织化学染色:对照组心肌组织在4℃放置3d内, H-FABP在心肌细胞胞浆内呈强阳性表达,未见明显的脱失区;4℃放置4d心肌内膜下出现部分小片状缺失。缺血区心肌组织均可见不规则点、灶、片状H-FABP缺失区;部分区域心肌细胞H-FABP阳性表达强度减弱。连续HE染色对比发现H-FABP缺失区及阳性表达减弱区的心肌细胞胞浆嗜伊红性增强、细胞核缩小而染色加深。梗死区与非梗死交界区域的心肌细胞内H-FABP阳性表达强度减弱与周围阳性表达的非缺血区心肌分界清楚。H-FABP在在对照组及心肌梗死组不同时间的缺失面积两两比较和统计分析表明:4℃放置3d内H-FABP阳性表达强度无明显减弱,缺失面积无增加;随着两组标本在4℃放置时间的延长,H-FABP阳性表达强度和阳性反应面积有减弱趋势。死后放置4d以内H-FABP脱失面积与相应正常对照组有显著性差异(p0.05),放置超过5d以上,其脱失面积与正常对照组无显著性差异(p0.05)。 结论: 1.大鼠心肌缺血后15min即可出现H-FABP脱失,随着缺血时间的延长,心肌细胞内H-FABP的缺失面积增加,心肌缺血4小时达到高峰。H-FABP检测心肌缺血敏感性强,能明确显示缺血3小时内的缺失区。所以H-FABP可用于死后病理诊断急性心肌缺血。 2.H-FABP的稳定性一般,受自溶影响相对较小。死后4℃放置4天以内,兔缺血区心肌和正常心肌细胞H-FABP表达有显著性差异。故H-FABP是一种敏感性强,稳定性一般的免疫组化指标。H-FABP的免疫组织化学染色在心肌缺血的死后诊断中有一定的法医学价值,可用于死后4℃放置4天以内的尸体的早期心肌梗死的死后诊断。


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