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微囊化神经组织联合脱细胞神经移植修复犬坐骨神经缺损的实验研究

王雷  
【摘要】: 本研究拟通过以海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠(Algin-Polylysine-Algin, APA)成分构成的微胶囊包裹大鼠坐骨神经组织,以化学萃取获得脱细胞的犬同种异体神经,将二者联合移植修复不同长度的犬坐骨神经缺损,研究针对“再细胞化”的脱细胞神经在神经修复再生中的作用和意义,为探索自体神经移植的替代方案方法提供理论和实验依据。 第一部分犬脱细胞同种异体神经的构建 目的:构建犬脱细胞同种异体神经。 方法:健康杂种犬10只,体重在10kg-15kg之间,健康雌性Wistar大鼠5只,体重在220-250g之间。采用Triton-X100和脱氧胆酸钠通过化学萃取方法来处理新鲜犬坐骨神经。钴-60γ射线辐照消毒灭菌后,通过大体观察、光镜观察、扫描电镜观察评价其组织形态.大鼠行脱细胞神经背部肌肉包埋实验,术后1周取出脱细胞神经作石蜡切片,HE染色;评价生物相容性。 结果:经过化学萃取后支架呈半透明状,较新鲜神经略有收缩。光镜观察、扫描电镜观察均未发现明显的细胞成分残留,仅剩下较完整的基底膜管道。肌肉包埋实验后1周支架周围有轻微的炎症反应,周围肌肉无明显坏死。 第二部分微囊化大鼠神经组织的制备及其生物活性的研究 目的:使用APA材料制备微囊化大鼠神经组织,并评价其移植体内后的生物活性. 方法:健康雌性Wistar大鼠5只,体重在220-250g之间,健康雄性昆明鼠20只,体重20~25g.切取大鼠双侧坐骨神经在胰酶消化下形成细胞组织块,使用APA材料利用微囊静电发生器将神经组织包裹,制成微囊化神经组织.采用注射的方法将一定数量的微囊化神经组织移植到小鼠的腹腔,术后6周回收微囊,计算回收率,接着对其体外培养3天,采用四唑盐(MTT)法﹑ELISA法检测NGF含量以及对回收微囊内神经组织进行再培养观察其生长情况等方法,综合评价其活性。 结果:微囊化神经组织移植体内6周后外型基本保持完整,回收率位于80~90%, MTT法﹑ELISA法均检测出囊内神经组织细胞仍有活性,将微囊内神经组织再培养时观察到细胞仍可贴壁,生长良好。 第三部分微囊化神经组织联合脱细胞神经移植修复犬坐骨神经短段缺损后靶肌肉变化的研究 目的:了解微囊化神经组织细胞与脱细胞神经联合移植桥接犬坐骨神经3cm缺损后腓肠肌的相应变化. 方法:将犬24只随机分为A、B、C 3组,每组8只。所有动物均人为手术造成单侧坐骨神经3cm缺损, A组:脱细胞神经辅加微囊化神经移植修复缺损;B组:单纯脱细胞神经移植修复缺损;C组:自体神经切断后原位倒置修复.术后定期观察犬的运动功能恢复情况,并于术后6个月、12个月行移植段神经运动传导速度检测,并切取双侧腓肠肌行琥珀酸脱氢酶(SDH)、突触素、运动终板染色,同时取脱细胞神经移植远端吻合口以远1cm处的神经行HE染色、MASSON染色、固蓝染色、S-100免疫组化染色、NF-200免疫组化染色等形态学检测。 结果:所有实验动物均纳入实验动物数量分析、无脱失。术后运动功能恢复及电生理检测方面, A、C组间差别不大,但明显优于B组.图象分析表明A组在术后6个月、12个月腓肠肌SDH光密度、肌纤维截面积、突触素及胆碱脂酶光密度和面积方面明显优于B组,而与C组无明显差别,脱细胞神经移植段吻合口远端神经形态学检测符合靶肌肉检测结论。 第四部分微囊化神经组织联合脱细胞神经移植修复犬坐骨神经中长段缺损后靶肌肉的研究 目的:了解微囊化神经组织细胞与脱细胞神经联合移植桥接犬坐骨神经6cm缺损后腓肠肌的相应变化。 方法:将犬24只随机分为D、E、F 3组,每组8只。所有动物均人为手术造成单侧坐骨神经6cm缺损, D组:脱细胞神经辅加微囊化神经移植修复缺损;B组:单纯脱细胞神经移植修复缺损;C组:自体神经切断后原位倒置修复。术后定期观察犬的运动功能恢复情况,于术后6个月、12个月行移植段神经运动传导速度检测,并切取双侧腓肠肌行琥珀酸脱氢酶(SDH)、突触素、胆碱脂酶运动终板染色,同时取脱细胞神经移植远端吻合口以远1cm处的神经行HE染色、MASSON染色、固蓝染色、S-100免疫组化染色、NF-200免疫组化染色等形态学检测。 结果:所有实验动物均纳入实验动物数量分析、无脱失。术后运动功能恢复情况及电生理检测, D、E、F组较术前均有明显差距, D、F组间差别不大,相对E组而言恢复效果要好.图象分析表明D组在术后6个月、12个月腓肠肌SDH光密度、肌纤维截面积、突触素及胆碱脂酶光密度和面积方面明显优于E组,而与F组无明显差别,脱细胞神经移植段吻合口远端神经形态学检测符合靶肌肉检测结论。 结论 [1]通过化学萃取脱细胞方法制备的脱细胞神经具有正常神经的天然孔隙和三维空间结构,材料的免疫原性基本上被去除,具有良好的细胞相容性和组织相容性。 [2]微囊化神经组织可在体内保持活性至少6周,囊内的细胞可正常生存并保持增殖功能,将其移植至体内以达到对脱细胞神经“再细胞化”是安全可行的. [3]微囊化神经组织与脱细胞神经联合移植修复短段(3cm)神经缺损后,在较短时间内大量神经纤维重新支配靶器官,使腓肠肌萎缩明显减弱,效果明显优于单纯脱细胞神经移植,与自体神经移植效果无显著差异性.单纯脱细胞神经移植效果似也在可勉强接受的水平,至于远期效果比较是否存在差异以及更长距离的再细胞化的必要性等问题仍需进一步深入研究. [4]微囊化神经组织与脱细胞神经联合移植修复中长段(6cm)神经缺损后,在一定时间内相当数量的神经纤维重新支配靶器官,使腓肠肌萎缩减弱得到一定程度的缓解,与自体神经移植效果无明显差异,尽管较之正常水平仍有不小的差距,但其效果明显优于单纯脱细胞神经移植,而后者效果明显不佳. [5]将6cm与3cm移植组同期比较后表明,在行较长神经缺损移植时再细胞化似乎更有必要,同时也证明以微囊化神经组织移植的形式进行再细胞化是安全有效和事实可行的.


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