新的甾体类药物NSC67657诱导HL60细胞分化时关键蛋白的筛选、鉴定及其功能研究

【摘要】： 目的 建立人急性早幼粒白血病细胞株HL60分别向粒系和单核系分化模型,运用比较蛋白质组学分析鉴定HL60细胞在甾醇类新药(NSC67657)和全反式维甲酸(all-trans retinoic acid ,ATRA)诱导下表达差异的蛋白质分子,并对其中筛选出来的差异蛋白β-catenin相关蛋白1(β-catenin-interacting protein 1,ICAT)进行功能研究。 策略与方法 1.验证NSC67657对CEBPα的促进作用并构建细胞分化模型:在基因和蛋白水平分析CEBPα在NSC67657作用下的表达变化情况,然后分别用NSC67657和ATRA作用HL60细胞,通过光镜、MTT试验、电镜、细胞表面分化抗原检测,细胞化学染色等方面,分析细胞分化方向,分化程度,以及诱导细胞分化最适药物浓度。通过流式细胞技术和电镜的联合使用,分析HL60细胞在诱导分化过程中凋亡的发生情况,保证后续蛋白筛查所得差异蛋白大部分和分化相关,而非和凋亡相关。 2. HL60细胞全蛋白双向电泳分离条件的优化:分别采用标准蛋白提取法、三氯乙酸/丙酮沉淀法、超声破碎法等蛋白提取方法,在传统电泳和改良电泳条件下进行细胞全蛋白分离,并做蛋白点计数数和凝胶重复性分析,寻找新的针对HL60细胞省时高效的双向电泳条件。 3.运用比较蛋白质组在最适电泳分离条件下,分析HL60细胞在分化前,和向单核、粒系分化后的差异表达蛋白谱:依照前面优化双向电泳分离条件,对分化前和向单核系、粒系分化后HL60细胞总蛋白进行分离,用PDquest(7.0)软件对扫描的二维凝胶电泳图像进行分析,筛选出HL60细胞分化前后差异表达蛋白斑点。候选差异表达蛋白斑点经胶内胰酶酶解,MALDI-TOF-MS分析,得到肽指纹图谱(peptide mass fingerprinting, PMF),使用Mascot软件在Swissprot数据库中检索鉴定差异表达蛋白质,并对差异蛋白质进行生物信息学分析。 4.验证仅出现在NSC67657处理组的差异蛋白点ICAT的表达差异情况,并对ICAT蛋白进行细胞内定位:使用NSC67657和ATRA分别作用HL60细胞,诱导其向两系分化,分别用RT-PCR、Western blot方法检测细胞分化前后ICAT在mRNA与蛋白水平的变化情况;然后双染ICAT蛋白和HL60细胞核,采用激光共聚焦的方法观察ICAT蛋白在细胞内的表达情况,并对其进行细胞内定位。 5. ICAT真核表达载体的构建、转染,并对转染细胞ICAT基因、蛋白的过表达进行验证:采用RT-PCR方法扩增加入了EcoR I和BamH I两个酶切位点的ICAT基因CDS全长序列,并克隆入带有红色荧光标签的真核表达载体pDsRed-C1,通过改良电转染技术,导入白血病HL60细胞和THP-1细胞,然后采用RT-PCR、Western blot方法对转染后细胞中ICAT基因和蛋白的高表达进行验证。 6.成功转染ICAT基因的HL60细胞生物学特征分析:采用MTT方法观察转染ICAT基因前后的HL60细胞在NSC67657作用下的增殖情况;应用流式细胞技术,细胞化学染色,电镜等方法检测转染前后及加有药物NSC67657作用前后细胞的分化情况。 7. ICAT基因在其他白血病细胞中的功能初探:采用流式细胞技术、和细胞化学染色方法观察NSC67657处理未转染和转染了pDsRed-ICAT真核表达载体的THP-1细胞分化情况。 结果 1.药物作用HL60细胞后,CEBPα基因和蛋白的表达呈现先升高后下降的趋势;NSC67657和ATRA对急性早幼粒细胞株HL60的增殖有明显抑制作用,半数抑制浓度(50% inhibitory concentration, IC50)分别是10μM和2μM。当用10μM NSC67657和2μM ATRA作用HL60细胞5天后,CD14和CD11b的表达分别达到90%以上,并出现明显肾形、畸形核的单核系分化细胞和呈杆状、分叶核的粒系分化细胞;胞浆可见较多嗜天青颗粒。未见细胞膜的磷脂酰丝氨酸外翻,细胞核染色质固缩及凋亡小体出现等凋亡现象; 2.在传统的高压聚焦的条件下,三种蛋白抽提方法所得蛋白分离条件不佳,可见大量横条纹和片状阴影;改良低压聚焦条件下,三种蛋白抽提方法所得蛋白分离均有所改善,三氯乙酸/丙酮沉淀法所得蛋白损失严重;超声破碎法所得蛋白点重复性差;标准蛋白抽提方法所得蛋白点数多,重复性好,结果可靠。蛋白分布于4～7居多,采用非线性pH3～10胶条最佳。 3.通过对分化前后的二维凝胶电泳图像进行对比分析,发现约有70个蛋白斑点表达有差异,对其中63个差异蛋白斑点进行MALDI-TOF-MS分析后,鉴定出了46种可能的差异表达蛋白。其中有24个差异蛋白点的变化趋势在两系分化中是相同的,有9个蛋白点仅在单核系分化后表达有差异,有13个蛋白点仅在粒系分化后表达有差异。 4. ICAT蛋白是仅在HL60细胞单核系分化前后表达差异的蛋白分子之一。通过验证,NSC67657处理后,ICAT在mRNA与蛋白水平都明显高于ATRA处理组和非处理对照组;激光共聚焦可见ICAT蛋白大多表达于细胞核和细胞浆中。 5.通过酶切、胶回收、测序,真核表达载体pDsRed-ICAT构建成功。随着改良电穿孔技术的支持,在成功转染了pDsRed-ICAT表达载体的HL60细胞中,验证了ICAT基因和蛋白的表达均明显增加。 6. pDsRed-ICAT真核载体转染HL60细胞前后,表面分化抗原CD14的表达无明显变化;NSC67657处理后,pDsRed-ICAT载体转染HL60细胞的增殖相对于对照组减慢更为明显,分化速度明显加快。 7. NSC67657可以诱导THP-1细胞向单核系分化,药物处理转染了pDsRed-ICAT真核载体的THP-1细胞相对于对照组,细胞增殖和分化无明显差异。 结论 1. NSC67657可以促进HL60细胞CEBPα的表达,并且10μM的NSC67657和2μM的ATRA可以在不伴随凋亡发生的情况下,成功诱导HL60细胞向单核系和粒系分化。 2.低压聚焦为真核细胞蛋白质组分析提供了又一高效,省时,可靠的蛋白质分离方法。 3.鉴定出的50种差异表达蛋白可能在NSC67657和ATRA诱导细胞分化的途径中起到重要作用。 4. ICAT蛋白仅在NSC67657诱导HL60细胞向单核系分化过程中表达升高。 5.外源性ICAT基因在HL60细胞和THP-1细胞中成功表达。 6. ICAT基因的过表达可以促进NSC67657诱导HL60细胞的分化进程,但不影响THP-1细胞的分化,说明ICAT蛋白可能是粒单系祖细胞定向分化的新的药物作用靶点。