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尿道下裂发病机制研究

刘星  
【摘要】: 背景:尿道下裂(Hypospadias)是小儿最常见的泌尿生殖道先天畸形。由于阴茎及前尿道发育不全,尿道开口异常伴阴茎下弯畸形,导致患儿不能站立排尿,并影响成年后性功能及生育力。手术矫正畸形是本病的唯一治疗措施,但术后并发症发生率较高,是患儿及家长的心患。为此,有关尿道下裂病因的研究受到学者们关注,以期通过尿道下裂病因学的研究寻找其预防、治疗学突破。 尿道下裂发病率约1/200~1/300,而且有逐年增加趋势,大量研究提示其发病率的增加与环境雌激素污染密切相关。邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯(DEHP)是一种广泛应用于塑料及化工产业的增塑剂,在医疗工作和日常生活中被大量应用,已构成我国严重的“白色污染”。DEHP进入环境后不易被降解,能蓄积于人体产生雌激素样生物活性。课题组前期研究已发现DEHP可损害实验动物睾丸及附睾功能导致小鼠隐睾畸形,可同时伴有尿道下裂的产生。虽有文献报道DEHP能诱发实验动物的尿道下裂,但是未就其机制深入研究。因此,本课题针对DEHP对外生殖器的毒性损伤,研究其致畸机制,为进一步防治尿道下裂发生提供科学依据。 目的:利用DEHP的外生殖器的毒性损伤,诱导胎鼠尿道下裂:体内外观察阴茎发育情况,检测细胞凋亡改变、TGF-β1及ATF3等在阴茎组织中的表达;对比尿道下裂患者与正常儿童包皮TGF-β1表达差异,深入探讨尿道下裂发生机制。 方法:1.将C57BL/6及KM孕鼠分为对照组与DEHP处理组,DEHP处理组分为100 mg/kg·d、200 mg/kg·d与500 mg/kg·d三个剂量组(DEHP_(100),DEHP_(200),DEHP_(500)),于妊娠12.5d~17.5d(GD12.5~17.5)期间灌胃;对照组于同期用0.1mL玉米油灌胃。于GD19剖腹取出胎鼠,对比观察胎鼠阴茎与尿道发育;尿道橡胶管型重塑胎鼠尿路情况,测量尿道长度;统计尿道下裂发生率。采用整体原位杂交(WISH)技术检测胎鼠阴茎中TGF-β1 mRNA的表达。 2.获取上述各组胎鼠及幼年鼠阴茎,运用免疫荧光、RT-PCR、western blot技术检测TGF-β1与ATF3的表达;经TUNEL染色观察阴茎内细胞凋亡情况,检测凋亡相关蛋白:Bcl-2、Bax及P53的表达。 3.取正常GD12.5胎鼠阴茎体外培养,分别经不同剂量的MEHP、TGF-β1细胞因子及MEHP+TGF-β1单克隆抗体干预,观察阴茎发育情况,运用RT-PCR对比TGF-β1与ATF3基因表达的变化。 4.取尿道下裂病人与正常儿童包皮,采用免疫组化、RT-PCR及荧光实时PCR方法检测TGF-β1表达,对比其差异。 结果:1.DEHP成功诱导出尿道下裂小鼠动物模型,尿道下裂表现为阴茎体变短、尿道开口异位、包皮分裂,DEHP_(100)、DEHP_(200)与DEHP_(500)尿道下裂发生率分别为7.1%、14.0%和75.7%;实验组雄性胎鼠体重及肛门尿道口距离(AGD)均值随DEHP剂量增加而逐渐减小(p<0.05);尿道橡胶管型显示尿道下裂胎鼠尿道变短,尤以前尿道明显,中高剂量组尿道长度较对照组明显缩短(p<0.001);阴茎连续切片显示实验组尿道轴偏向阴茎腹侧,尿道板向腹侧隆起及融合过程落后。WISH检测发现胎鼠阴茎中TGF-β1 mRNA特异表达于尿道板及尿道上皮。 2.RT-PCR、免疫荧光及western blot均显示在胎鼠阴茎内,TGF-β1与ATF3 mRNA与蛋白的表达随DEHP剂量的增加而逐渐增强,而在生后20d及40d小鼠阴茎内,TGF-β1 mRNA的表达显著低于正常对照;阴茎细胞的凋亡减少伴P53表达下降,而Bcl-2/Bax比值无明显变化。 3.体外培养条件下胎鼠阴茎能够较好生长,MEHP及TGF-β1细胞因子能显著抑制阴茎发育。MEHP不能上调TGF-β1及ATF3 mRNA的表达,TGF-β1细胞因子也不能上调ATF3 mRNA的表达,TGF-β1抗体不能抑制ATF3 mRNA的表达。 4.尿道下裂患儿包皮中TGF-β1表达具有低于正常儿童趋势。 结论:DEHP诱导胎鼠尿道下裂可能与其上调TGF-β1及ATF3表达有关,TGF-β1及ATF3的异常表达可能是尿道下裂发生机制的关键环节,但TGF-β1可能不与ATF3产生信号传导。


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