收藏本站
收藏 | 论文排版

DNA生物传感器快速检测病原微生物的实验研究

鲁卫平  
【摘要】: 随着分子生物学和生物技术的发展,DNA分子识别技术不断提高。相比传统的以微生物表型特征为基础的检测方法,基于DNA识别技术的分子生物学检测方法,具有快速、敏感性和特异性高的优点,非常适用于病原微生物的临床检测和鉴定。同时随着越来越多的动植物、微生物基因组序列得到测定,这些巨量的信息为我们开启了进行大量生物学分析和检测的大门。DNA生物传感器是集分子生物学、现代物理、现代化学、微电子技术于一体的新型基因分析技术,具有快速、敏感、高效、高通量等优点,在生物工程、临床医学、环境监测、食品分析等领域具有重要的意义。目前已有包括光学传感器、石英晶体传感器、电化学传感器等众多类型的DNA传感器,根据是否选用标记物,这些传感器可分为标记型和非标记型两大类。标记型DNA传感器对DNA的识别,是通过检测DNA上标记的信号分子所引起的光学、电化学等信号的改变。非标记型DNA传感器则直接检测DNA杂交形成复合体过程中引起的光学、质量以及电化学的改变。 本研究主要分两部分,第一部分我们将真菌核糖体分型技术、DNA生物传感器技术和纳米金信号放大技术相结合,以纳米金为信号分子,建立了一种适合临床实验室应用的病原性真菌检测DNA传感器检测系统。第二部分我们将表面等离子体共振(surface plasmonresonance,SPR)传感器技术与肽核酸探针技术相结合,对无信号分子的DNA的直接、简便、快速检测方法进行了初步探索。实验的主要方法及结果如下: 第一部分基于纳米金的标记型生物传感器同时检测多个病原性真菌1.通过查阅文献报道并进行临床调查,确定以20余种临床常见的病原性真菌为检测目标,包括念珠菌、曲霉菌、毛霉菌、皮肤癣菌等。 2.通过临床常见病原性真菌,包括酵母菌、浅部真菌和深部真菌共14个属30种真菌的核糖体RNA(ribosomal RNA,rRNA)基因序列的比对,以真菌5.8S rRNA基因和28S rRNA基因的保守序列,设计真菌通用引物,可扩增真菌5.8S rDNA部分序列、ITS 2(内转录间隔区2).全序列、28S rDNA的部分序列。利用该通用引物建立了真菌rRNA基因通用PCR扩增方法并进行了优化。该通用PCR方法对20种靶真菌均可扩增出目的DNA带,大小在259~531 bp之间。所有非真菌样品扩增结果均为阴性。 3.为简化PCR方法和减少标本用量,利用基因释放剂直接制备病原性真菌DNA模板。该方法操作非常快速、简单,整个模板制备过程仅需30min左右,而传统方法通常都需要2h以上。 4.在相同条件下利用AlleleID 6.0软件设计了针对各靶真菌ITS2序列的种特异性寡核苷酸探针,利用生物信息学方法对所有探针进行分析筛选,并利用反向膜杂交技术进行验证。结果表明所选用探针特异性强、可靠性好,且探针间Tm值相差仅1℃,具有相同的杂交条件。 5.建立并优化了纳米金显色目视DNA芯片检测系统,包括:最佳点样探针浓度;最适杂交温度、杂交时间;最佳银染显色方法;自身质量控制系统。该技术具有很好的特异性,对热带念珠菌扩增产物和白色念珠菌的检测敏感性分别达到50fmol/L和10cfu/ml,且检测结果可以用肉眼直接观察或普通光学仪器记录。 6.为验证该检测技术用于临床样品检测的可靠性和实用性。用该检测系统对临床样品直接进行检测,分别检测了真菌感染标本的阳性培养物、加入标准菌株制备的模拟临床标本以及含菌的临床标本。本法的检测结果与常规经典检测鉴定方法结果一致,证明本检测方法准确可靠,可用于临床样品的检测。 以上结果表明:我们建立的通用PCR结合纳米金DNA传感器技术,具有敏感、特异、操作简单快速的优点。整个检测过程可在6h内完成,而传统方法需要2~4天。与传统的基因芯片技术相比,其技术和设备要求、检测成本大大降低。能部分满足临床检测的通量要求,适合在临床开展,有望成为临床微生物实验室传统真菌检测技术理想的替代方法。 第二部分基于SPR和bis-PNA的非标记型生物传感器 1.采用一种全新的二维SPR折射率成像方法—“并行扫描光谱表面等离子体共振成像方法”。这项技术具有SPR传感器一贯的高折射率灵敏度的特点,且能提供定量的被测平面的二维折射率分布图,其中每点的亮度值与折射率直接线性对应;本方法采用线形光束照明探测,一次探测一维区域,扫描探测二维平面区域,探测速度快,具有很高的信息通量。 2.针对流感病毒M基因,设计合成了bis-PNA探针。其中Hoogsteen链的C碱基用J(pseudoisocytosine)碱基检测替换,消除了C碱基在杂交过程中需要质子化的影响,使探针在中性杂交环境中具有较好的稳定性,既保证其高结合率又有较好的特异性。 3.将巯基修饰的bis-PNA探针固定在金膜上,制成微阵列,直接与甲型流感病毒M基因扩增产物杂交,然后进行SPR扫描分析。该技术检测敏感性为1pmol/L的双链DNA分子。 结合并行扫描光谱表面等离子体共振传感器系统和bis-PNA技术,我们构建了一种无需任何标记的生物传感器技术,并进行了初步验证。结果表明该方法可直接检测双链DNA,无需对其进行变性处理。具有操作简单快速、检测通量高的优点。但目前离实际应用还有一段距离,在探针的设计、杂交条件、检测系统的稳定性等方面还需进一步优化提高。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 陈至善!200052上海,熊显华!200052上海;肾癌细胞增殖活性与预后的关系[J];临床肿瘤学杂志;1998年02期
2 张秀荣,孟如松,李春启,毛高平,王建荣;大肠癌及各类型大肠息肉流式细胞DNA定量研究[J];空军总医院学报;1998年03期
3 原银栋,刘庆阳,原泉,赵耀;恶性骨肿瘤中血管内皮生长因子表达的定量研究[J];中华骨科杂志;1999年07期
4 陈建庭,李菊根,金大地;血小板衍生生长因子促进成骨细胞DNA合成的实验研究[J];中华外科杂志;1999年07期
5 张淑娟,宋炜辉;治疗淋菌性结膜炎的用药观察[J];黑龙江医药科学;1999年03期
6 李秀珍;微波对脑的影响[J];国外医学.卫生学分册;2000年05期
7 邱方城,熊琛,严礼华,张志华,郑卫东;PCR检测HBVDNA的初步研究[J];郧阳医学院学报;2000年01期
8 李昕权,李丰益,廖清奎,罗春华;白血病随机扩增多态DNA分析及其临床意义[J];中国小儿血液;2000年06期
9 武大林;HLA方法学进展及其DNA分型应用[J];第一军医大学学报;2001年06期
10 沈波;外周血白细胞中结核分枝杆菌DNA检测结果与肺结核类型关系[J];黑龙江医药科学;2001年05期
11 李彩霞,郑秀芬;单核苷酸多态性研究进展及其在医学中的应用[J];国外医学.分子生物学分册;2002年04期
12 刘彦,赵亚南;卵巢癌细胞DNA含量定量测定的显微分光光度法和图像分析系统的比较[J];第二军医大学学报;1992年02期
13 刘爱平,周元恺;从小肠中提取高纯动DNA的一种改进法[J];第四军医大学学报;1992年05期
14 张宏;随机扩增多态性DNA在医学真菌鉴定与分子流行病学研究中的应用[J];国外医学.皮肤性病学分册;1995年04期
15 刘世信,韩洪秋,赵丽中,朱理玮,梁辉;直肠癌远端切除2cm是安全的吗?(41例直肠癌流式细胞DNA分析结果)[J];中国肿瘤临床;1997年05期
16 余日安,陈学敏;镉对大鼠肝细胞DNA损伤作用的研究[J];中国公共卫生学报;1998年02期
17 周晓慧;DNA与免疫[J];承德医学院学报;1998年02期
18 陶震江,万林忠,叶玉霞,熊美萍,陈伟丽,顾慧巍;口腔颌面部病变组织中人乳头瘤病毒DNA的检测[J];口腔医学;1998年03期
19 王占祥,张传山,章翔,费舟,张志文,张剑宁,宋少军,晏培松;细胞核DNA含量与神经系统良恶性肿瘤关系的研究[J];肿瘤防治研究;1998年06期
20 林慰慈!100083,魏雪涛!100083,买买提·克里木!100083,薛宏伟!100083,林华,张思园!100083,周宗灿!100083;一氧化氮供体硝普钠致DNA单链断裂的试验研究[J];中华预防医学杂志;1999年06期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 刘海英;陈刚;步宇翔;;碱基对的多铜修饰对DNA导电性的增强作用[A];中国化学会第28届学术年会第13分会场摘要集[C];2012年
2 赵宏远;李俊杰;桑润滋;;单细胞凝胶电泳技术检测不同处理山羊精子DNA损伤[A];中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会第十五届学术研讨会论文集(下册)[C];2010年
3 刘玲;付强;朱化彬;彭秀丽;郝海生;杜卫华;赵学明;王栋;;牛毛囊基因组DNA制备方法的比较研究[A];中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会第十五届学术研讨会论文集(上册)[C];2010年
4 梁春柳;;一个新的筛选化合物与DNA交互作用的简便方法[A];2010年全国药物毒理学学术会议论文集[C];2010年
5 张文众;李永宁;方瑾;梁春来;张倩男;;体外新评价方法——完整细胞核DNA检测板[A];全国生化/工业与卫生毒理学学术会议论文集[C];2010年
6 邹丹丹;汪海林;;基于DNA甲基化结合蛋白MBD的甲基化分析[A];中国化学会第28届学术年会第2分会场摘要集[C];2012年
7 张晔;杜智;杨斌;高英堂;;检测外周血中游离DNA的应用前景(综述)[A];天津市生物医学工程学会第29届学术年会暨首届生物医学工程前沿科学研讨会论文集[C];2009年
8 赵淑珍;刘光珍;;DNA免疫吸附治疗狼疮性肾炎的临床观察[A];第十一届全国中西医结合肾脏病学术会议论文汇编[C];2010年
9 陈士林;;中药DNA条形码鉴定体系[A];第十届全国药用植物及植物药学术研讨会论文摘要集[C];2011年
10 陆佳飞;周克隆;王缦;;磁珠法快速提取乙型肝炎病毒DNA的研究及其在诊断试剂中的应用[A];第五次全国免疫诊断暨疫苗学术研讨会论文汇编[C];2011年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 郭晓兰;端粒功能异常诱导的DNA损伤反应及其在肿瘤发生中的作用与分子机制[D];重庆医科大学;2010年
2 陈志健;1.8 GHz微波对X射线和阿霉素致淋巴细胞DNA损伤修复及对蛋白表达的影响[D];浙江大学;2010年
3 朱慧芳;Y家族DNA聚合酶对化学致癌物MNNG应答的转录调控研究[D];浙江大学;2009年
4 万超;抗猪瘟嵌合DNA疫苗及TRIF的DNA疫苗佐剂效应研究[D];武汉大学;2009年
5 赵丽霞;克隆绵羊印记相关基因的DNA甲基化研究[D];内蒙古农业大学;2010年
6 沈美龙;基于DNA免疫的乙型肝炎病毒表面抗原大中小蛋白的免疫原性研究[D];南京医科大学;2010年
7 徐铁刚;细菌DNA磷硫酰化修饰与限制[D];上海交通大学;2008年
8 高鹏;特异性介导DNA转导的多结构域嵌合蛋白的构建、表达及鉴定[D];吉林大学;2011年
9 康大伟;DNA分子器件场效应理论研究[D];山东大学;2010年
10 高天;基于寡核苷酸芯片的地中海贫血特异性DNA甲基化的研究[D];第三军医大学;2009年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 李芳;基于磁性微粒的法医样本DNA纯化[D];西北大学;2011年
2 芦丽淦;柚皮素及聚乙二醇增强乙肝DNA疫苗免疫效果的研究[D];河南大学;2010年
3 杨锦艳;六种香豆素有效成分与DNA相互作用的研究[D];山西医科大学;2010年
4 林启凰;用于乳腺蛋白标志基因检测的DNA电化学生物传感器的研究[D];福建医科大学;2010年
5 于文静;亚麻韧皮部特异启动子克隆与26份种质DNA指纹图谱构建[D];中国农业科学院;2010年
6 Rebecca Simisola Agboola;硼(B)和氯化钠胁迫处理诱导高粱(Sorghum bicolor)自交系发生形态和DNA甲基化的变异[D];东北师范大学;2010年
7 石微;溴氰菊酯致大鼠DNA损伤及损伤后修复功能的影响[D];青岛大学;2010年
8 张诺;DNA-纳米羟基磷灰石修饰电极的制备及在生物分析中的应用[D];济南大学;2010年
9 郭珈辰;基于图形表示的DNA相似性分析及进化树构建算法研究[D];湖南大学;2010年
10 刘香港;基于功能材料的新型电化学DNA生物传感器的研制及应用研究[D];山东农业大学;2011年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 陈杰;信息技术将重组汽车DNA[N];科技日报;2010年
2 刘霞;科学家研发出新型人工合成DNA载体[N];科技日报;2010年
3 南方;化危为机 企业需韧性生长的DNA[N];中国企业报;2009年
4 吴强;港大引新技术DNA辨食材[N];中国食品质量报;2010年
5 本报记者 施晓焰 通讯员 马丽娟;云南:DNA数据库成“打拐”得力帮手[N];人民公安报;2009年
6 张巍巍;垃圾DNA可促进癌症发展首获证实[N];科技日报;2010年
7 常丽君;虱子DNA表明人类17万年前首次穿衣[N];科技日报;2011年
8 记者 冯卫东;DNA碱基序列决定其光敏性假设获证实[N];科技日报;2008年
9 许文强;拆、装更便捷的DNA双螺栓结构模型[N];大众科技报;2008年
10 记者 常丽君;研究人员发现自组装DNA链的最佳长度[N];科技日报;2010年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978