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DNA生物传感器快速检测病原微生物的实验研究

鲁卫平  
【摘要】: 随着分子生物学和生物技术的发展,DNA分子识别技术不断提高。相比传统的以微生物表型特征为基础的检测方法,基于DNA识别技术的分子生物学检测方法,具有快速、敏感性和特异性高的优点,非常适用于病原微生物的临床检测和鉴定。同时随着越来越多的动植物、微生物基因组序列得到测定,这些巨量的信息为我们开启了进行大量生物学分析和检测的大门。DNA生物传感器是集分子生物学、现代物理、现代化学、微电子技术于一体的新型基因分析技术,具有快速、敏感、高效、高通量等优点,在生物工程、临床医学、环境监测、食品分析等领域具有重要的意义。目前已有包括光学传感器、石英晶体传感器、电化学传感器等众多类型的DNA传感器,根据是否选用标记物,这些传感器可分为标记型和非标记型两大类。标记型DNA传感器对DNA的识别,是通过检测DNA上标记的信号分子所引起的光学、电化学等信号的改变。非标记型DNA传感器则直接检测DNA杂交形成复合体过程中引起的光学、质量以及电化学的改变。 本研究主要分两部分,第一部分我们将真菌核糖体分型技术、DNA生物传感器技术和纳米金信号放大技术相结合,以纳米金为信号分子,建立了一种适合临床实验室应用的病原性真菌检测DNA传感器检测系统。第二部分我们将表面等离子体共振(surface plasmonresonance,SPR)传感器技术与肽核酸探针技术相结合,对无信号分子的DNA的直接、简便、快速检测方法进行了初步探索。实验的主要方法及结果如下: 第一部分基于纳米金的标记型生物传感器同时检测多个病原性真菌1.通过查阅文献报道并进行临床调查,确定以20余种临床常见的病原性真菌为检测目标,包括念珠菌、曲霉菌、毛霉菌、皮肤癣菌等。 2.通过临床常见病原性真菌,包括酵母菌、浅部真菌和深部真菌共14个属30种真菌的核糖体RNA(ribosomal RNA,rRNA)基因序列的比对,以真菌5.8S rRNA基因和28S rRNA基因的保守序列,设计真菌通用引物,可扩增真菌5.8S rDNA部分序列、ITS 2(内转录间隔区2).全序列、28S rDNA的部分序列。利用该通用引物建立了真菌rRNA基因通用PCR扩增方法并进行了优化。该通用PCR方法对20种靶真菌均可扩增出目的DNA带,大小在259~531 bp之间。所有非真菌样品扩增结果均为阴性。 3.为简化PCR方法和减少标本用量,利用基因释放剂直接制备病原性真菌DNA模板。该方法操作非常快速、简单,整个模板制备过程仅需30min左右,而传统方法通常都需要2h以上。 4.在相同条件下利用AlleleID 6.0软件设计了针对各靶真菌ITS2序列的种特异性寡核苷酸探针,利用生物信息学方法对所有探针进行分析筛选,并利用反向膜杂交技术进行验证。结果表明所选用探针特异性强、可靠性好,且探针间Tm值相差仅1℃,具有相同的杂交条件。 5.建立并优化了纳米金显色目视DNA芯片检测系统,包括:最佳点样探针浓度;最适杂交温度、杂交时间;最佳银染显色方法;自身质量控制系统。该技术具有很好的特异性,对热带念珠菌扩增产物和白色念珠菌的检测敏感性分别达到50fmol/L和10cfu/ml,且检测结果可以用肉眼直接观察或普通光学仪器记录。 6.为验证该检测技术用于临床样品检测的可靠性和实用性。用该检测系统对临床样品直接进行检测,分别检测了真菌感染标本的阳性培养物、加入标准菌株制备的模拟临床标本以及含菌的临床标本。本法的检测结果与常规经典检测鉴定方法结果一致,证明本检测方法准确可靠,可用于临床样品的检测。 以上结果表明:我们建立的通用PCR结合纳米金DNA传感器技术,具有敏感、特异、操作简单快速的优点。整个检测过程可在6h内完成,而传统方法需要2~4天。与传统的基因芯片技术相比,其技术和设备要求、检测成本大大降低。能部分满足临床检测的通量要求,适合在临床开展,有望成为临床微生物实验室传统真菌检测技术理想的替代方法。 第二部分基于SPR和bis-PNA的非标记型生物传感器 1.采用一种全新的二维SPR折射率成像方法—“并行扫描光谱表面等离子体共振成像方法”。这项技术具有SPR传感器一贯的高折射率灵敏度的特点,且能提供定量的被测平面的二维折射率分布图,其中每点的亮度值与折射率直接线性对应;本方法采用线形光束照明探测,一次探测一维区域,扫描探测二维平面区域,探测速度快,具有很高的信息通量。 2.针对流感病毒M基因,设计合成了bis-PNA探针。其中Hoogsteen链的C碱基用J(pseudoisocytosine)碱基检测替换,消除了C碱基在杂交过程中需要质子化的影响,使探针在中性杂交环境中具有较好的稳定性,既保证其高结合率又有较好的特异性。 3.将巯基修饰的bis-PNA探针固定在金膜上,制成微阵列,直接与甲型流感病毒M基因扩增产物杂交,然后进行SPR扫描分析。该技术检测敏感性为1pmol/L的双链DNA分子。 结合并行扫描光谱表面等离子体共振传感器系统和bis-PNA技术,我们构建了一种无需任何标记的生物传感器技术,并进行了初步验证。结果表明该方法可直接检测双链DNA,无需对其进行变性处理。具有操作简单快速、检测通量高的优点。但目前离实际应用还有一段距离,在探针的设计、杂交条件、检测系统的稳定性等方面还需进一步优化提高。


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