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人肝再生增强因子免疫抑制机制研究

王新国  
【摘要】: 目的:人肝再生增强因子( human augmenter of liver regeneration, hALR)是一种非特异性的、具有热稳定性的、促肝细胞再生的细胞因子,能抑制单核细胞的增殖和细胞因子INF-γ、IL-2的产生,但抑制机制仍不明确。MAPK/ERK、PKC-NF-KB、钙离子信号通路是外周血单核细胞活化的主要通路,是很多免疫抑制剂作用的靶点,目前不清楚ALR是否抑制这几条通路发挥免疫抑制作用,因此,本研究拟从体外观察ALR对外周血单核细胞这三条信号通路的影响,明确ALR的作用机制。 凋亡是免疫抑制的另一种重要方式,我们前期发现rALR能诱导大鼠单核细胞凋亡,但是机制仍不明确,是通过减少免疫营养因子IL-2抑或刺激凋亡信号通路?因此,本研究也观察人ALR对凋亡相关的信号通路Caspse-3及IL-2等细胞因子的影响,以期探明ALR免疫抑制机制。 方法: 1ALR对MAPK /ERK的影响 1)观察ALR抑制ConA促PBMC增殖作用的最佳时间和浓度用MTT法观察ConA(5ug/ml)在16h、40h、60h对PBMC的促增殖作用,以P0.01的时间作为ConA促PBMC增殖的最佳作用时间;选定60h时间点,观察系列浓度ALR(0.5ug/ml、1ug/ml、2ug/ml、7.5ug/ml、10 ug/ml、15 ug/ml、30 ug/ml)抑制ConA的促增殖作用,以P0.01的浓度作为ALR的最佳浓度。 2)观察MAPK/ERK的变化根据最佳时间(60h)和浓度(30 ug/ml),将细胞分成正常对照组(Normal control ,N)、ALR对照组、ConA和ALR+ConA组,利用Western Blot法观察ALR在60h对MAPK/ERK的影响。 3)动态观察MAPK/ERK的变化在明确ERK变化的基础上,继续观察ALR在10min、30min、1h、2h、4h、8h、16h、32h、40h时间点对ERK的影响,以明确ALR抑制ERK的过程。 2 ALR对Ras的影响利用Western Blot法观察ALR对Ras的影响及其影响是否与ERK同步,从而确定ALR是否经Ras-MAPK/ERK通路抑制细胞增殖。 3 ALR对PKC-NF-KB通路的作用用Western blot法观察PKC、NF-KB的变化,以明确ALR在培养中期是否通过抑制PKC-NF-KB起免疫抑制作用。 4 ALR对钙离子信号通路的作用在明确ALR对以上两条信号通路的作用后,ALR在4-8h的作用通路仍不明确,因此进一步观察钙离子信号通路变化。利用钙离子敏感探针装载,荧光分光光度计动态检测细胞内钙离子浓度的变化,利用甲基百里香酚蓝比色法检测细胞培养上清液中的钙离子浓度。 5 ALR对凋亡的作用利用流式细胞仪检测ALR对PBMC凋亡的影响,用凝胶电泳法观察DNA是否降解,用Western Blot法观察ALR是否有活化Caspase-3的作用。 6ALR对IL-2、IL-4、IL-10的影响用ELISA方法检测细胞培养上清中IL-2、IL-4、IL-10的动态变化。 结果 1 ALR对MAPK/ERK的影响 1)ConA对单个核细胞的增殖作用随时间的增加而逐渐增强,16h和40h时增殖明显(p=0.0413,0.0479),60h时最显著(p0.01)。ALR抑制增殖呈剂量依赖关系,剂量为30 ug/ml时抑制作用最明显(p0.01)。 2)ERK在60h的变化与正常组比较,ConA组磷酸化的ERK含量及非磷酸化的ERK含量均增加;ALR组磷酸化的ERK2含量减少。ALR+ConA组磷酸化及非磷酸化的ERK含量较ConA组均减少,并以磷酸化的ERK2减少为主。各组磷酸化ERK与非磷酸化ERK之比没有差异。 3)ALR对ERK的动态影响磷酸化ERK含量变化: ConA组磷酸化ERK的含量在1h时较正常组明显增加,ALR组磷酸化ERK的含量在10min和1h时。ALR+ConA组磷酸化ERK的含量在10min、30min和1h时较ConA组明显减少,以ERK2为主;各组磷酸化ERK的含量在4h以后均无明显差别,且达到最低值。 非磷酸化ERK含量变化:各组非磷酸化ERK的含量随时间逐渐增加,在4-16h达到较高水平,之后下降,40h最低。 2 ALR对ras的影响在整个细胞培养过程中,各组Ras呈多次波动,其中N组(10min-1h、1-8h、8-40h)和ConA组(10min-1h、1-4h、4-40h)Ras呈现3次波动,而ALR+ConA组(1-8h、8-40h)和ALR组(1-8h、8-40h)出现2次。ALR+ConA组Ras在10min-1h之间明显被抑制,程度明显低于ConA组,以30min为著;之后变化与ConA组并行。ALR组Ras除1h低于N组外,之后均与N组并行。ConA组和ALR+ConA组细胞内Ras在16h均明显低于正常组。 3 ALR对PKC-NF-KB通路的作用各组PKC、NF-KB表达的总体变化趋势一致,PKC-NF-KB系统在细胞培养8h之后发生改变,ConA组PKC、NF-KB表达的最高值在16h,ALR+ConA组PKC、NF-KB表达最高值明显后移,在32h。ALR+ConA组PKC、NF-KB抑制最强点在16h 4 ALR对PBMC钙离子信号通路的作用除ALR+ ConA组钙离子在4h之前没有波动外,各组细胞内钙离子均有先升高后下降的现象,ALR组钙离子水平在30min时达到最高点;ConA组细胞内钙离子浓度最高点在1h,N组细胞内钙离子浓度最高点在2h。各组之间钙离子水平在4h时没有统计学差异。8h后ALR组出现两次波动。 5 ALR对PBMC凋亡的作用60h之前,各组细胞没有凋亡;60h时,ALR组和ConA组细胞早期凋亡与正常组明显增加;而ALR+ConA组较ConA组细胞早期凋亡明显减少。60h时,ALR+ConA组Caspase-3含量较ConA组明显减少。 6 ALR对细胞因子的影响ALR组IL-2的分泌最高峰在16h, IL-10峰值在32h,与ConA组IL-2和IL-10分泌峰值相同。ALR+ConA组IL-2峰值推迟,IL-10峰值提前。 结论 1 ALR通过抑制Ras-MAPK/ERK2通路从而抑制ConA的促人PBMC增殖作用。 2 ALR对未经ConA刺激的人PBMC MAPK/ERK具有双向调节作用,早期促进ERK的磷酸化,晚期抑制ERK2的磷酸化。 3 ALR通过抑制细胞内钙离子信号从而抑制人PBMC增殖。 4 ALR对未经ConA刺激的人PBMC胞内钙离子有双向调节作用,早期启动钙离子信号通路,晚期抑制钙离子信号通路。 5 ALR通过抑制PKC-NF-KB通路,从而影响细胞增殖和细胞因子分泌。 6 ALR通过影响人PBMC凋亡发挥免疫调节作用。 7 ALR通过IL-10抑制IL-2抑制免疫。


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