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大蒜素对铜绿假单胞菌生物被膜的干预作用及机制初步研究

林丽华  
【摘要】: 第一部分大蒜素对铜绿假单胞菌生物被膜早期黏附及胞外多糖的影响 目的研究大蒜素对铜绿假单胞菌PAO1菌株生物被膜(biofilm,BF)早期黏附及胞外多糖复合物(Extracellular Polymeric Substances,EPS)的影响。 方法利用荧光多功能酶标仪检测各组不同时间96孔板中pGFP质粒转化PAO1菌株的荧光强度,通过计算黏附率以表示大蒜素对不同时间点细菌黏附的影响;利用荧光显微镜下定性观察细菌的黏附量;应用异硫氰酸标记的刀豆蛋白A(FITC conjugated concanavalin A,FITC-conA)特异性结合细菌EPS,荧光显微镜下定性观察各组EPS的变化;利用硫酸-苯酚法定量各组细菌EPS的产量。 结果6小时组,大蒜素高浓度干预后细菌的黏附率由(0.70±0.03)下降至(0.50±0.01),t=15.014, P0.05,大蒜素低浓度干预后黏附率也有下降,但不及高浓度组明显;除了9小时组其他时间组趋势与6小时组大致相似,可能与大蒜素不稳定性有关。荧光显微镜观察可见生理盐水对照组细菌菌落分布,干预组黏附的细菌稀疏散在分布,以高浓度为甚。FITC-conA可显色胞外多糖,在荧光显微镜下观察可见大蒜素干预后EPS减少,稀薄;EPS定量实验,大蒜素高浓度干预组EPS总量(181.19±1.59)μg较生理盐水对照组(602.66±21.94)μg有明显降低,t=60.589, P0.05。 结论大蒜素可显著减少PAO1菌株黏附及产EPS的能力。 第二部分大蒜素对铜绿假单胞菌生物被膜形成过程的影响及结构定量化分析 目的利用激光共聚焦显微镜(Confocal Laser Scanning Microscopy, CLSM)观察大蒜素对铜绿假单胞菌PAO1菌株生物被膜(biofilms,BF)形成过程的影响,并用ISA(Image Structure Analyzer)软件对BF结构进行定量化分析。 方法体外建立1d, 3d, 7d组PAO1菌株BF模型,每组分3小组,分别于生理盐水、大蒜素128μg/ml、大蒜素10μg/ml作用6小时。通过荧光探针SYTO9/PI标记,利用CLSM进行动态观察,并用ISA软件对其BF结构进行定量分析。 结果(1)生理盐水对照组1d, 3d, 7d的厚度分别为12.94±0.55μm,23.98±0.99μm,28.83±3.67μm,可见厚度随时间的增加而增加,但在后3d增加的速度减慢;同时区域孔率(Areal Porosity,AP)各时间组分别为0.89±0.01,0.85±0.02,0.76±0.10,呈下降趋势,;平均扩散距离(Average Diffusion Distance,ADD)有逐渐增加趋势,各时间组分别为1.68±0.13,1.71±0.08,2.54±0.33;结构熵(Textural Entropy,TE)有增加的趋势,各时间组分别为5.62±0.89,6.15±0.82,6.78±0.0.93。(2) 7d组模型中,大蒜素128μg/ml作用后,BF厚度由(28.83±0.67)μm减少到(16.50±0.69)μm;AP由(0.76±0.10)增加到(0.92±0.02);TE由(6.78±0.93)减少到(5.33±0.43)。10μg/ml大蒜素干预后,有同样趋势,但效应不如高浓度明显。(3) 1d,3d模型组,大蒜素作用后同对照组相比:厚度,AP,TE的差别均有统计学意义,P0.05,趋势同7d组。 结论ISA软件可以对大蒜素对PAO1菌株BF形成的影响进行结构定量分析,大蒜素对各个时间段BF的形成均有影响,高浓度128μg/ml,效果更显著。 第三部分大蒜素联合环丙沙星的抗菌作用及对铜绿假单胞菌生物被膜的影响 目的通过体外构建铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)生物被膜(biofilms,BF)模型,研究大蒜素联合环丙沙星的体外抗菌作用及对铜绿假单胞菌BF的影响。 方法采用棋盘法设计,微量肉汤稀释法测定,测定不同浓度组合的抗菌药物对铜绿假单胞菌最低抑菌浓度(Minimal Inhibitory Concentration MIC) ,并计算部分抑菌浓度(fractional inhibitory concentration,FIC)指数,判定联合效应。FIC指数≤0.5,协同作用;0.5FIC指数1,部分协同作用;FIC = 1.0,相加作用;1FIC指数4,无关作用;FIC指数≥4,拮抗作用;并利用甲基四氮唑蓝(3-[4, 5-dimethyl-2-thiazolyl]-2, 5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide,MTT)活菌计数法和荧光显微镜考察联合应用抗菌药物对铜绿假单胞菌生物被膜的影响。 结果大蒜素与环丙沙星联合应用后,两者MIC显著降低,FIC指数为0.2578125;1/2、1/4 MIC的大蒜素可显著增加1/2、1/4 MIC的环丙沙星对铜绿假单胞菌生物被膜的抑菌活性,玻片上活细菌明显减少,单独应用两种抗生素仍以菌落分布为主;与生理盐水对照组大致相当。 结论大蒜素与环丙杀星联合应用后,对铜绿假单胞菌BF表现为协同作用。 第四部分大蒜素对铜绿假单胞菌群体密度感应系统调控毒力因子表达的影响 目的通过体外测定铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)群体密度感应(Quorum Sensing,QS)系统调控的毒力因子的表达,比较大蒜素干预前后毒力因子表达的差异以及对铜绿假单胞菌PAO1成熟BF的影响。 方法应用ELISA的方法,比较处理前后外毒素A的含量差异;利用弹性蛋白-刚果红染色的方法,测定处理前后弹性蛋白酶活性;用蒽酮-硫酸法测定鼠李糖脂,测定波长553nm;荧光酶标仪检测青脓素含量变化;利用激光共聚焦观察干预前后对铜绿假单胞成熟BF的影响。 结果大蒜素干预后与生理盐水对照组比较,外毒素A、弹性蛋白酶、鼠李糖脂和青脓素表达分别由( 19.630±0.573 ) pg/μl、(0.467±0.003)、(2.009±0.063)g/L、(9325.833±367.675)下降到( 6.529±0.289 ) pg/μl、( 0.032±0.001 )、( 0.269±0.009 ) g/L、(7819.167±111.800)。激光共聚焦观察可见生理盐水对照组可见细菌密集,BF表面粗燥不平,层叠如集云状,BF厚度较厚29μm左右,大蒜素120μg/ml干预下,BF厚度有明显减少,约18μm左右,纵切面见呈扁平状,结构较稀疏,细菌散在分布。 结论大蒜素可抑制铜绿假单胞菌群体密度感应系统调控毒力因子表达,减弱其毒力,干扰BF分化成熟。


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