早孕小鼠胚胎着床前后子宫内膜microRNAs差异表达及miR-106b表达规律研究

【摘要】： 目的: 应用microRNAs(miRNAs)芯片筛选早孕小鼠胚胎着床前后子宫内膜差异表达miRNAs,进行实时荧光定量PCR验证,运用靶基因预测数据库预测差异表达miRNAs调控的靶基因,为研究其在早孕小鼠胚胎着床过程中的作用打下基础;通过数据库的筛选,对靶基因指向与胚胎着床子宫内膜增殖相关的miR-106b在早孕小鼠胚胎着床前后子宫内膜表达规律进行研究,为研究miR-106b在胚胎着床过程中对子宫内膜的作用机制打下基础。 方法: 1.样本的准备:分别收集孕4天和孕6天的小鼠子宫内膜组织。 2. miRNAs芯片分析:提取小鼠子宫内膜组织的总RNA,总RNA用miRCURYTM LNA Array labeling kit(Exiqon, Denmark)使用Cy3按照说明书标记。Cy3标记的RNA用miRCURYTM LNA Arrays(Exiqon, Denmark)进行杂交。通过Gene Pix 4000B扫描仪和Gene Pix 6.0软件(Axon Instruments, Union City, CA)进行图像扫描和数据分析。 3.荧光定量PCR检测部分差异表达miRNAs:根据miRNA成熟序列设计特异性的反转录引物进行反转录,设计miRNA PCR上下游引物进行实时荧光定量PCR,采用U6作为内参,进行归一化。 4.生物信息学分析:应用目前常用miRNAs靶基因预测网站Targetscan、Pictar、miRBase来检索差异表达miRNAs的预测靶基因。 5.原位杂交:原位杂交检测miR-106b在胚胎着床前后子宫内膜的表达量和表达部位。 结果: 1.miRNAs芯片结果显示:孕6天比孕4天上调2倍及以上的miRNAs有17个;下调2倍及以上miRNAs有18个。实时荧光定量PCR结果显示芯片数据可靠。通过Targetscan、Pictar、miRBase等数据库筛查,初步获得差异表达的部分miRNAs多指向与增殖、凋亡和抗凋亡相关的靶基因。 2. miRNAs芯片、实时荧光定量PCR和原位杂交显示:miR-106b在孕4天的表达高于孕6天2倍以上,且主要表达在小鼠子宫内膜基质细胞,在腔上皮细胞和腺上皮细胞没有表达。提示miR-106b可能通过调控其靶基因而调控早期妊娠子宫内膜基质细胞的生长、增殖、分化和凋亡。 结论: 1.本研究结果显示孕6天与孕4天相比,存在差异表达的miRNAs,提示miRNAs可能在胚胎着床前后子宫内膜中起重要的调控作用。 2.利用实时荧光定量PCR进一步验证了部分差异表达的miRNAs,对这些miRNAs在孕6天和孕4天子宫内膜组织的表达量进行定量检测,验证了miRNAs芯片结果的可靠性。 3.利用生物信息学方法,预测差异表达的miRNAs的靶基因,推测这些miRNAs可能通过调节增殖、凋亡和抗凋亡相关的靶基因来调控胚胎着床。 4.实时荧光定量PCR检测miR-106b在胚胎着床前后子宫内膜存在差异表达,提示其可能通过调控相关靶基因进而调控胚胎着床。原位杂交检测miR-106b主要表达在小鼠子宫内膜基质细胞,根据数据库和相关文献分析,提示miR-106b可能通过调控Npm1、Tsg101和PTEN等靶基因的表达,进而调控早期妊娠子宫内膜基质细胞的生长、增殖、分化和凋亡,最终调控胚胎着床过程。