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涎腺腺样囊性癌细胞中PTEN基因启动子区甲基化状态的研究

范小平  
【摘要】: 背景: 肿瘤的发生是一个多因素、多阶段相互作用、累积渐进的过程,是一系列内因和外因共同累积的结果,其产生的根本原因可以认为是基因损害造成的。在细胞癌变原理的研究中认为:细胞癌基因的显性作用是对细胞增殖的正调节机制,多数学者认为通常要有两个或两个以上癌基因的协同作用才能发生正常细胞的恶变。除了癌基因活化外,尚有抑癌基因的沉默,亦会引起细胞的癌变。抑癌基因对细胞增殖起着负调控作用,其活性的丧失或降低也是促使正常细胞发生恶变的重要机制。 涎腺腺样囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma,SACC)是最常见的涎腺恶性肿瘤之一。涎腺腺样囊性癌在小涎腺中发病率较高,最常见于腭部、腮腺及颌下腺,其次为舌下腺,发生于舌下腺的恶性肿瘤多为腺样囊性癌。涎腺腺样囊性癌的发生率无明显性别差异。儿童期极罕见,多见于40~60岁。肿块呈圆形或结节状,大小不一。肿块小者可活动,轻微疼痛;肿块大者质硬,多数边界不清,活动性差,有的较固定,与周围组织相粘连。其生物学特性为生长较为缓慢,但侵袭性强,常沿神经、血管生长,易复发和颈淋巴结转移率低。 PTEN基因(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten,PTEN)是第一个被发现的具有双特异性磷酸酶活性的抑癌基因。PTEN基因位于染色体10q23.3区有9个外显子和8个内含子,长1212bp,编码由403个氨基酸组成的蛋白,其产物的相对分子量为56kDa。其结构包括N端磷酸酶结构域、C2结构域和C端尾区。 有研究表明:抑癌基因PTEN与多种肿瘤的发生、发展关系密切。PTEN基因主要具有调节细胞生长周期、诱导细胞凋亡以及抑制肿瘤细胞生长、侵袭转移等功能;还在以下多种生理活动中发挥重要作用,如:胚胎的生长、发育,细胞黏附和迁移,细胞分化,细胞衰老与凋亡,维护免疫系统的稳定,抑制血管生成等。其作用机制尚未完全清楚,但目前认为主要由以下三条途径共同完成:①磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸(phosphatidylinosito1-3,4,5-trisphosphate,PIP3)途径;②丝裂原激酶(mitogen.activated protein kinase, MAPK)途径;③局部粘附激酶(focal adhesion kinase , FAK)途径。 PTEN基因发生异常可能由于杂合子丢失、无义突变、某种形式的内部剪切异常、错义突变、启动子甲基化等方面的原因造成,从而致使PTEN表达水平下调或沉默。目前PTEN基因启动子的甲基化在肿瘤发生中的作用研究较多,对正常涎腺组织及涎腺癌组织的研究中发现,抑癌基因PTEN在正常涎腺组织中呈现高表达,在涎腺癌中则为低表达或失表达。而在对肝癌、肺癌、子宫颈癌,乳腺癌、口腔鳞状细胞等的研究中则证实了PTEN基因的甲基化水平与PTEN mRNA逆转录水平及蛋白的表达下降或失表达相关;但PTEN在涎腺腺样囊性癌中低表达的机制是什么?是否与其他肿瘤中发现的PTEN基因启动子的甲基化状态相关? 目的: 本实验拟研究人正常涎腺细胞和涎腺腺样囊性癌细胞中抑癌基因PTEN表达的差异和甲基化状态的差异,以及甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-Aza-2′- deoxycytidine, 5-Aza-dc)处理涎腺腺样囊性癌细胞,使PTEN基因去甲基化后对该细胞中PTEN基因表达的影响,从而明确PTEN基因启动子区的甲基化对涎腺腺样囊性癌中PTEN基因表达的影响及其机制,为临床涎腺腺样囊性癌基于PTEN的早期诊断和基于甲基转移酶抑制剂治疗策略的应用提供一定的理论依据。 材料与方法: 1、收集正常涎腺组织临床样本,对样本处理后进行原代培养,利用细胞不同的贴壁能力分离出正常的涎腺细胞,采用HE染色对正常涎腺进行图像分析,同时采用MTT [3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐]比色法观察不同接种密度对原代正常涎腺组织细胞生长的影响,通过分析得到最佳的接种密度。 2、按TAKARA试剂说明书提取正常涎腺细胞和涎腺腺样囊性癌细胞ACC-2的总RNA,行反转录PCR,PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳,用Bio-Rad凝胶图像成像仪观察结果,分析PTEN基因在正常涎腺细胞和涎腺腺样囊性癌细胞ACC-2中的表达差异。 3、运用设计程序“MethPrimer”软件( http: / /www. urogene. org/methprimer/ )对位于染色体10q23.3区的PTEN基因5′侧翼区的2.1kb序列进行分析,预测CpG岛并根据其序列设计甲基化特异性PCR引物;按试剂盒说明书提取正常涎腺细胞与涎腺腺样囊性癌细胞ACC-2中的DNA,经硫化后行MSP,用Bio-Rad凝胶图像成像仪观察结果,分析正常涎腺细胞和涎腺腺样囊性癌细胞(ACC-2)中PTEN基因启动子区甲基化状态的差异。 4、涎腺腺样囊性癌(ACC-2)接种于6孔板,24小时后用10μmol/L甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-Aza-dc)分别处理24h、48h、72h后提取总RNA,运用RT-PCR检测mRNA的表达,运用Bio-Rad凝胶图像成像仪分析5-Aza-dc对PTEN mRNA表达的影响。 涎腺腺样囊性癌(ACC-2)接种于6孔板,24小时后用10μmol/L甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-Aza-dc)分别处理24h、48h、72h后提取细胞总蛋白,BCA法测蛋白浓度,运用western免疫印迹(Western blotting,WB)检测PTEN蛋白表达,运用Bio-Rad凝胶图像成像仪分析5-Aza-dc对PTEN蛋白表达的影响。 5、对涎腺腺样囊性癌细胞ACC-2(购自四川大学华西医学院生物细胞实验室)进行培养,采用计数法和MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐)比色法观察腺样囊性癌细胞增长速率和甲基转移酶抑制剂是否对正常涎腺组织细胞和涎腺腺样囊性癌细胞生长有影响。 结果: 1、正常涎腺细胞原代培养中可见:多种细胞成分混合生长,主要由成纤维细胞和正常涎腺细胞组成,利用其贴壁能力的不同可将其分离出;采用MTT比色法可见:在一定的接种密度范围内,正常涎腺组织细胞生长随接种密度的增加而加快,但随着时间的增加,接种密度越高,原代正常涎腺组织细胞生长越缓慢,并在后期开始出现原代正常涎腺组织细胞凋亡,最后得到在0至72小时培养时间内不出现原代正常涎腺组织细胞大量凋亡的最佳接种密度为5×105/孔(以6孔板为标准)。 2、PTEN基因在原代正常涎腺组织细胞和涎腺腺样囊性癌细胞(ACC-2)中均见表达。原代正常涎腺组织细胞的PTEN基因表达明显高于涎腺腺样囊性癌细胞(ACC-2)中PTEN基因的表达。运用Bio-Rad凝胶图像成像仪对RT-PCR产物电泳图片的灰度值进行定量分析:原代正常涎腺组织细胞的PTEN基因表达明显高于涎腺腺样囊性癌细胞(ACC-2)中PTEN基因的表达。 3、运用“MethPrimer”引物设计软件对PTEN基因5′侧翼区的3 kb序列分析,可见该区段内有6个CpG岛;而对PTEN基因甲基化水平的检测发现,原代正常涎腺组织细胞的PTEN基因甲基化水平较涎腺腺样囊性癌细胞(ACC-2)中PTEN基因甲基化水平低。 4、涎腺腺样囊性癌细胞(ACC-2)经甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-Aza-dc)处理后,空白组、24小时处理组、48小时处理组、72小时处理组PTEN基因mRNA均有表达,随处理时间的增加,PTEN基因mRNA的表达会逐渐增加,运用Bio-Rad凝胶图像成像仪对RT-PCR产物电泳图片的灰度值进行定量分析:24小时处理组、48小时处理组、72小时处理组的灰度值明显高于空白组(P0.05);24小时处理组、48小时处理组、72小时处理组三组间的灰度值差别不大(P0.05)。 涎腺腺样囊性癌细胞(ACC-2)经甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-Aza-dc)处理后,空白组、24小时处理组、48小时处理组、72小时处理组PTEN蛋白均有表达,随处理时间的增加,PTEN蛋白的表达会逐渐增加,运用Bio-Rad凝胶图像成像仪对western免疫印迹图片进行定量分析:24小时处理组、48小时处理组、72小时处理组的灰度值明显高于空白组(P0.05);24小时处理组、48小时处理组、72小时处理组三组间的灰度值差别不大(P0.05)。 2、在一定的培养时间内,涎腺腺样囊性癌细胞(ACC-2)的生长速率中显示细胞群体倍增时间约为接种后25.8小时,细胞群体分裂指数约在72小时达到峰值,用MTT比色法观察为发现甲基转移酶抑制剂对涎腺腺样囊性癌的生长有一定影响。 结论: 生理状况下,抑癌基因PTEN在正常组织与细胞中呈现高表达,而在癌组织与细胞中则出现低表达甚至失表达,故PTEN基因可能对肿瘤的发生、发展有重要的作用。当PTEN基因出现沉默时,细胞衰老与凋亡出现异常,肿瘤细胞生长、侵袭、转移、凋亡及细胞周期出现异常,造成肿瘤的发生。因此PTEN基因的水平可能是肿瘤早期诊断的一个重要指标。同时在甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-Aza-dc)作用于ACC-2后,PTEN mRNA转录水平上调、PTEN蛋白的表达升高,故PTEN基因在肿瘤中的低表达与其启动子区的高甲基化可能存在相关,由于PTEN基因是肿瘤发生、发展的机制中的重要基因,就为肿瘤早期诊断、预防、治疗提供了新的思路。可见,PTEN基因在唾液腺腺样囊性癌中的表达及其甲基化研究对唾液腺肿瘤的发生机制的阐明具有重要的意义,为唾液腺肿瘤的早期诊断和临床治疗中提供新的治疗方案提供了一定的理论依据。


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