胃癌miRNA表达谱及胃癌中显著下调的miR-9和miR-433的功能研究

【摘要】： 目的检测胃癌中微小RNA(microRNA,miRNA)表达谱;筛选胃癌特异性miRNA,验证胃癌相关miRNA的作用靶点,建立一种新的诊断和治疗胃癌的方法。 方法采用基因芯片技术检测3份正常胃组织标本,24份胃癌组织标本(早期胃癌组织2份,进展期胃癌组织22份),胃癌细胞SGC7901和人胃上皮细胞系-1(Gastric epithelial cell line 1,GES-1)中328个miRNAs的表达情况。挑选基因芯片结果中感兴趣的miRNAs,并采用实时定量多聚酶链反应(Quantitative Real-Time polymerase chain reaction, qRT-PCR)对其进行验证。通过生物信息网络平台预测目的miRNAs的作用靶点。全基因合成预测靶点3’端非翻译区(3’-untranslated region,3’-UTR)中含有目的miRNA绑定位点的片段,将该片段克隆于荧光素酶报告基因载体pGL3-control的下游,称pGL3-miRNA。分4组转染SGC7901:①SGC7901添加脂质体作为空白对照组。②单独转染空质粒pGL3组。③单独转染pGL3-miRNA组。④pGL3-miRNA加目的miRNA共转染组。转染后培养48小时,检测荧光素酶活性。为了检测目的miRNA对预测靶点的作用程度,分3组转染SGC7901:①空白对照:SGC7901添加脂质体。②处理组1:转染50pmol目的miRNA入SGC7901。③处理组2:转染100pmol目的miRNA入SGC7901。转染后培养48小时,采用免疫印迹(Western blot,WB)检测靶蛋白变化。同时,用qRT-PCR检测各组目的miRNA的变化。 结果基因芯片检测发现共有26个miRNAs在胃癌标本中异常表达(包括24份胃癌组织和SGC7901)。其中19个miRNAs下调(其表达值至少比正常组低2.2倍),7个miRNAs上调(其表达值至少比正常组高2.1倍)。挑选胃癌中显著下调的miR-9和miR-433作为研究对象。qRT-PCR检测发现, miR-9在75%的胃癌组织中下降约75.4%(P0.01)。在胃癌细胞SGC7901中下降约76.2%(P0.01)。miR-433在83%的胃癌组织中下降约83.3%(P0.01),在胃癌细胞SGC7901中下降约77.3%(P0.01)。该结果与基因芯片结果一致。通过生物信息网络平台预测出miR-9和miR-433的作用靶点分别是RAS癌基因家族成员RAB34和生长因子受体绑定蛋白2(growth factor receptor-bound protein 2,GRB2)。重组质粒pGL3-miR-9和pGL3-miR-433分组转染后,检测荧光素酶活性,pGL3-miR-9加miR-9共转染组比pGL3-miR-9单独转染组降低约50%(P0.01);pGL3-miR-433加miR-433共转染组比pGL3-miR-433单独转染组降低约54%(P0.01)。按要求分别转染miR-9,miR-433入SGC7901,相对空白对照组,RAB34在处理组1中下降约45%(P0.01),在处理组2中下降约72%(P0.01);GRB2在处理组1中下降约53%(P0.01),在处理组2中下降约89%(P0.01)。同时,采用qRT-PCR检测各组目的miRNA的变化。相对空白对照组,miR-9在处理组1中增加1.3倍(P0.01),在处理组2中增加2.8倍(P0.01)。miR-433在处理组1中增加1.6倍(P0.01),在处理组2中增加3.0倍(P0.01)。 结论初步筛选出26个胃癌相关miRNAs。其中显著下调的miR-9和miR-433可作为进展期胃癌特异性miRNAs。二者分别通过负向调控肿瘤相关蛋白RAB34和GRB2而参与胃癌的发病机制。同时,为建立一种新的以miRNAs为基础的诊断和治疗胃癌的方法提供了相关信息。