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下调PTEN基因介导的NR2B信号通路对偏头痛大鼠的防治作用

申崇标  
【摘要】: 偏头痛是一种给病人身心健康带来严重危害的常见病和多发病,关于其发病机制有多种学说。目前用于治疗偏头痛的药物较多,但治疗效果并不理想,因此,寻找对偏头痛信号通路关键环节或相关靶点有调节作用的药物,提高偏头痛治疗的有效性,成为了当今医学研究热点之一。 本研究主要检测N-甲基-D-天门冬氨酸受体( N-methyl-D-aspartate receptor,NMDAR)NR2B亚基在偏头痛模型大鼠三叉神经节的表达情况,探讨其在偏头痛发病机制中的相互关系及作用,利用RNAi重组腺病毒(AdR-siPTEN)(第10号染色体同源丢失性磷酸酶张力蛋白基因phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten,PTEN)下调偏头痛大鼠模型三叉神经节的PTEN基因,探讨其对偏头痛大鼠行为学的影响,以及经NR2B信号途径对NO的调控情况,从理论上探讨PTEN siRNA腺病毒用于偏头痛防治的可能性。 实验方法: 1.制作硝酸甘油型实验性偏头痛大鼠模型:以Sprague-Dswley(SD)大鼠为动物模型对象,随机分为对照组和模型组,对照组以生理盐水代替硝酸甘油注射;模型组分为1小时组、4小时组、8小时组、12小时组,24小时组,皮下注射硝酸甘油注射剂10mg/kg。处死后取三叉神经节组织,待下部处理 2.RT-PCR法半定量检测三叉神经节组织NR2B mRNA表达量,免疫组织化学法检测三叉神经节组织NR2B蛋白表达量。 3.SD大鼠随机分为除假手术组、硝酸甘油模型组(GTN)、AdR-siPTEN下调组(AdR-siPTEN+GTN)、腺病毒空载组(腺病毒保存液+ GTN ,Ad-RFP对照组)。AdR-siPTEN转染大鼠三叉神经节后,转染成功后向除假手术组外其他三组SD大鼠皮下注射硝酸甘油注射剂10mg/kg,建立实验性偏头痛动物模型,假手术组大鼠皮下注射等体积生理盐水。观察大鼠行为学变化,造模4小时后处死,取三叉神经节组织并用RT-PCR和Western blotting法进行相关基因的mRNA和蛋白检测。 4.一氧化氮合酶(NOS)测定试剂盒、一氧化氮测定试剂盒测定各观察组三叉神经节组织内NOS、NO含量。 主要结果和结论: 1.与对照组相比,模型组大鼠三叉神经节NR2B基因mRNA和蛋白在不同时间点表达发生改变,造模后1小时NR2B基因和蛋白表达即开始升高,在4小时内差异明显(P0.05),达到高峰,随后呈下降趋势,24h后表达量接近正常,基因变化无统计学意义(P0.05)。说明NR2B参与偏头痛的发生发展过程并在其中有重要作用。 2.大鼠转染腺病毒1周后,大鼠三叉神经节组织出现红色荧光蛋白阳性表达,RT-PCR结果显示:与假手术组相比,GTN组PTEN mRNA表达无明显差异(P0.05),Ad-RFP对照组与GTN组的PTEN mRNA表达量无明显差异(P0.05), AdR-siPTEN组PTEN mRNA表达量为Ad-RFP对照组的53.16%,具有显著差异(P0.05)。Western blot结果显示,与假手术组相比,Ad-RFP对照组和GTN组的PTEN蛋白表达量无明显差异(P0.05), AdR-siPTEN组与假手术组和Ad-RFP对照组相比,具有显著差异(P0.05)。表明通过RNA干扰有效抑制了偏头痛大鼠三叉神经节PTEN基因的表达。 3.当PTEN基因表达下调时,有效缓解了偏头痛导致的大鼠挠头和爬笼等行为,RT-PCR结果显示:与假手术组相比GTN组NR2B mRNA表达明显升高(P0.05),差异具有统计意义,Ad-RFP对照组与假手术组相比NR2B mRNA表达明显升高(P0.05),差异具有统计学意义,AdR-siPTEN组与假手术组相比NR2B mRNA表达量无明显差异(P0.05), AdR-siPTEN组与GTN组NR2B mRNA表达量明显降低,具有显著差异(P0.05),AdR-siPTEN组与Ad-RFP对照组的相比,NR2B mRNA表达量明显降低,具有显著差异(P0.05);Western blot结果显示,与假手术组相比,Ad-RFP对照组和GTN组的NR2B蛋白表达量明显升高,差异具有统计学意义(P0.05), AdR-siPTEN组与GTN组和Ad-RFP对照组相比,NR2B蛋白表达量降低,具有显著差异(P0.05)。同时,与GTN组和Ad-RFP对照组相比,AdR-siPTEN组能明显降低三叉神经节组织内NOS、NO含量(P0.05),说明下调PTEN基因对偏头痛大鼠具有一定保护作用。


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