治疗高尿酸血症UOX脂质纳米粒的初步研究

【摘要】： 尿酸酶(Uricase, UOX)在嘌呤代谢途径中有重要的作用,它以分子氧作为受体催化尿酸的分解。大多数哺乳动物体内含有UOX,可将核酸组成单位中嘌呤核苷酸的代谢产物尿酸分解成溶解度比尿酸高的尿囊素;而人体内缺乏UOX,嘌呤分解代谢只能生成尿酸,随后尿酸经肾脏排泄,这就导致人体内血尿酸的浓度高于其他哺乳动物。当尿酸生成速度超过肾脏的排泄能力时,血浆尿酸水平会显著升高,造成高尿酸血症。UOX可以显著降低血浆中的尿酸水平,并可以治疗由高尿酸血症继发引起的痛风和肾脏疾病等。脂质纳米粒作为药物的载体,具有缓释性,靶向性,降低药物毒性等特点。 本文制备了UOX脂质纳米粒并对其理化性质进行研究,以期延长UOX在体内的作用时间,提高酶的活性,增加稳定性,降低免疫原性和抗原性。 方法: 1.采用葡聚糖凝胶G-200层析柱分离脂质纳米粒与游离药物,用考马斯亮兰G-250染色法测定蛋白质的含量,从而测定包封率。 2.采用逆向蒸发法制备UOX脂质纳米粒。运用单因素设计,筛选UOX脂质纳米粒的最佳处方。 3.通过测定酶的活性,考察UOX脂质纳米粒和UOX的最适温度、最适pH值及米氏常数(Km)。采用荧光分光光度法对含有异硫氰酸荧光素(FITC)的空白脂质体、UOX脂质体以及UOX进行荧光扫描,考察UOX与膜的相互作用。 4.通过测定酶的活性,考察UOX脂质纳米粒和UOX的贮存稳定性、热稳定性、酸碱稳定性、抗胰酶水解能力和部分有机化合物对尿酸酶的酶活力的影响。 5.分别以UOX脂质纳米粒和UOX作为抗原免疫大鼠,制备抗UOX血清,通过ELISA法进行血清抗UOX抗体效价检测,比较大鼠体内的免疫原性。 6.采用次黄嘌呤500 mg/kg和氧嗪酸钾100 mg/kg构建大鼠高尿酸血症动物模型,对UOX脂质纳米粒进行体内初步药效学研究。 结果: 1.采用葡聚糖凝胶G-200层析柱分离脂质纳米粒与游离药物。UOX的凝胶层析柱平均回收率为98.29%。表明该法操作简便,灵敏度高,重现性好,专属性强,能准确测定UOX脂质纳米粒中UOX的含量及包封率。 2.优化工艺制备得到UOX脂质纳米粒的最佳处方为:醚水比为3:1;SPC:CH=1:1;投药量为2 mg。在最佳处方条件下,平均包封率为64.24%,平均粒径为206.73 nm,多分散系数为0.247,Zeta电位为-37.33 mV。 3.UOX脂质纳米粒与UOX的最适温度均为40℃,并且UOX脂质纳米粒的活性明显高于游离UOX。在最适温度下,UOX脂质纳米粒的最适pH值为8.0,而游离UOX的最适pH值为8.5,且UOX脂质纳米粒的活性明显高于游离UOX。UOX脂质纳米粒的Km低于游离UOX,说明UOX脂质纳米粒与底物之间的亲和力增加。 采用荧光分光光度法对含有异硫氰酸荧光素(FITC)的空白脂质体、UOX脂质体以及UOX进行荧光扫描,结果表明UOX分子与FITC之间存在静电作用和疏水作用,因而UOX脂质纳米粒中UOX与脂质膜有相互作用。 4.稳定性实验结果表明,在贮存稳定性、热稳定性、酸碱稳定性、抗胰酶水解能力和部分有机化合物对酶活力的影响方面,UOX脂质纳米粒的稳定性均明显高于UOX。 5.免疫原性实验结果表明,以UOX脂质纳米粒和UOX为抗原制备的大鼠抗血清效价分别为1: 500和1: 8000,说明UOX脂质纳米粒能有效降低免疫原性。 6.体内初步药效学实验表明,注射UOX脂质纳米粒后,尿酸从高浓度(489.61μmol/L)降到人的正常浓度(240μmol/L)时间低于3 h,然而在注射UOX后从高浓度降到人的正常浓度则多用了6 h。UOX脂质纳米粒抑制尿酸水平高达88.72%。在静脉注射UOX纳米粒后,尿酸水平在12 h时达到最低水平(55.24μmol/L),与此同时,UOX组降到189.94μmol/L,模型组则只降到271.67μmol/L。体内药效学研究表明在大鼠模型上UOX脂质纳米粒能更明显的降低尿酸水平。 结论: 本文成功制备了UOX脂质纳米粒,其包封率高,提高了酶的活性,增加了稳定性,降低了免疫原性,并在体内可以明显降低血尿酸的水平。