壳寡糖和栀子苷体外抗氧化及炎症损伤的保护机制

【摘要】： 天然产物因资源丰富,成本低廉,使用方便,毒副作用小而普遍被用于医疗保健,系统研究天然产物的抗氧化及抗炎作用具有重要的现实意义。壳寡糖(COS)来源于蟹壳,水溶性好,安全无毒、易被吸收,且作为食品添加剂被广泛使用;栀子是药食两用传统中药,其中栀子苷(GE)含量最高,在栀子的药用效果中起重要作用。本课题选用这两种天然产物通过其抗氧化、抗炎作用为主要研究内容,对其潜在的治病防病机制进行深入探讨,以期为今后可能的临床应用奠定理论基础。 小胶质细胞最为一种免疫调节细胞均匀的分布在中枢神经系统,当其受到外界炎症因子的刺激时可以被活化。活化的小胶质细胞能产生活性氧族物质,导致神经损伤和变性,从而导致老年性神经退行性疾病,例如阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD )和帕金森症(Parkinson’s disease, PD)等。而人脐静脉内皮细胞(HUVEC)作为血管的第一道防线,对血液中的炎症刺激非常敏感,容易造成内皮损伤,从而引发动脉粥样硬化(AS)等病变。这也是老年人群易感疾病。因此,从天然产物中寻找活性成分防止此类疾病的发生、发展已成为当务之急。 本课题从体外和细胞实验证实了壳寡糖具有良好的抗氧化作用,并对炎性损伤的N9小胶质细胞的活化具有保护作用;对其机制研究发现壳寡糖主要是通过抑制细胞内NO和ROS的产生达到防止细胞发生凋亡的作用。此外,还探讨了栀子苷对HUVEC炎性损伤的保护作用和分子机制,以栀子苷对细胞间粘附分子-1(ICAM-1)的调控为核心,运用分子生物学技术检测炎症损伤后的细胞所发生的改变,证明栀子苷对LPS诱导的HUVEC细胞中ICAM-1表达升高有抑制作用,其分子机制研究表明栀子苷对LPS诱导的炎症损伤的保护作用与MAPK/NF-κB信号通路密切相关。 第一部分壳寡糖对自由基的清除及对N9小胶质细胞的保护作用 目的探索壳寡糖(chitooligosaccharide,COS)的抗氧化作用及其对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)损伤N9小胶质细胞的保护作用。 方法首先在细胞外检测COS对DPPH自由基、H2O2和羟自由基的清除作用;然后采用LPS诱导建立体外培养N9小胶质细胞活化模型,将细胞分为正常对照组、LPS模型组、LPS+COS给药组(COS浓度分别为50、100、200、300、400μg/mL)。观察各组细胞的形态;检测各组细胞培养液中一氧化氮(NO)含量;用流式细胞仪检测细胞内活性氧(ROS)水平并观察其荧光图像;用DNA损伤实验观察各组细胞凋亡情况。 结果COS能有效清除DPPH自由基和羟自由基,对H2O2直接清除能力弱;COS能减少活化的N9细胞数量,并明显降低LPS活化的N9细胞培养液中NO水平、降低细胞内ROS水平,减少LPS诱导的细胞凋亡,保护N9小胶质细胞。 结论COS对N9小胶质细胞具有较强的抗氧化能力,能保护N9小胶质细胞免受LPS激活,减轻N9小胶质细胞的氧化损伤。 第二部分栀子苷通过阻断ERK、P38和NF-ΚB信号通路抑制LPS刺激HUVEC导致的ICAM-1高表达 目的研究栀子苷对脂多糖(LPS)所致人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的细胞间粘附分子-1(ICAM-1)表达的影响及其分子机制。 方法用LPS刺激HUVEC,比较有无栀子苷预处理或P38抑制剂SB203580、ERK抑制剂PD98059时ICAM-1的表达。检测栀子苷对P38、ERK的磷酸化和NF-ΚB的核转位影响。 结果栀子苷有效的降低了LPS导致ICAM-1在HUVEC上的增高,并降低了P38、ERK的磷酸化,阻止了NF-ΚB的核转位。加入P38抑制剂SB203580或ERK抑制剂PD98059时ICAM-1表达下调。 结论栀子苷通过阻断ERK、P38和NF-κB信号通路抑制了LPS刺激HUVEC导致的ICAM-1高表达。