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RNA干扰沉默PDGF-D基因对胃癌细胞SGC-7901影响的实验研究

赵林  
【摘要】: 第一部分PDGF-D和VEGF在胃癌中的表达及临床意义 目的探讨血小板源性生长因子D(Platelet-derived growth factor-D, PDGF-D)和血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor ,VEGF)在胃癌中的表达及其与胃癌临床病理特征的关系。 方法用免疫组织化学(SP法)检测组织中PDGF-D和VEGF蛋白的表达,用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)对其中的40例胃癌组织标本进行PDGF-D和VEGF mRNA的半定量分析,分析两者之间的相关性及其与临床病理特征之间的关系。 结果胃癌组织中PDGF-D和VEGF蛋白的表达显著高于癌旁组织和正常胃组织(P0.05);PDGF-D和VEGF的表达与胃癌的TNM分期、浸润深度及淋巴结转移有关(P0.05),PDGF-D的表达还与胃癌的分化程度有关(P0.05); PDGF-D和VEGF在mRNA水平和蛋白水平的表达均呈正相关(均P0.05)。 结论PDGF-D和VEGF在胃癌组织中特异性高表达,可能在胃癌的发生、发展与转移中起着重要作用。 第二部分RNA干扰抑制SGC-7901细胞PDGF-D表达的研究 目的构建PDGF-D的shRNA质粒载体,检测其在胃癌细胞株SGC-7901中对PDGF-D表达的抑制作用,并筛选出其稳定表达细胞株。 方法设计合成两条针对靶基因(PDGF-DmRNA)的干扰序列和阴性对照序列,连接至pGPU6/GFP/Neo载体上,分别转染至胃癌细胞株SGC-7901,RT-PCR和Western Blot检测干扰后胃癌细胞株SGC-7901的PDGF-DmRNA和PDGF-D蛋白表达量,筛选出抑制效率高的质粒,用G418筛选出稳定表达干扰序列的胃癌细胞株。 结果酶切电泳分析和DNA测序证实成功构建PDGF-D-shRNA质粒,转染48小时后与未处理组和阴性对照组相比,PDGF-D-shRNA1,PDGF-D-shRNA2重组载体均能使SGC-7901细胞中PDGF-D基因在mRNA和蛋白水平上的表达明显下调(P0.05),且后者抑制效果更好;其抑制率在mRNA和蛋白水平分别达68.2%和65.2%(P0.05)。并成功筛选出稳定表达的胃癌细胞株。 结论构建的重组质粒PDGF-D-shRNA2能有效抑制PDGF-D基因在胃癌细胞中表达,且成功筛选出其稳定表达细胞株,为下一步研究打下基础。 第三部分RNA干扰下调PDGF-D表达对胃癌SGC-7901的生物学特性的影响及其机制的研究 目的研究下调胃癌细胞SGC-7901的PDGF-D表达对其体外增殖、粘附、迁移、侵袭、血管形成的影响及其机制。 方法分别检测PDGF-D下调前后的胃癌细胞SGC-7901生物学特性的变化,MTT法检测细胞增殖,流式细胞检测细胞周期,粘附实验检测细胞粘附力,划痕实验检测细胞迁移,Transwell小室检测细胞侵袭,以及对脐静脉血管内皮细胞的管状结构形成的影响;利用Western Blot和ELISA法检测与PDGF-D相关信号通路的因子表达的变化。 结果下调PDGF-D的表达后,胃癌细胞SGC-7901的增殖、粘附、迁移、侵袭、血管形成都受到一定程度的抑制(P0.05);细胞周期分析发现,S期细胞减少,而G0/G1期细胞增加(P0.05);Cyclin D1、MMP-2、MMP-9、VEGF蛋白和核内的β-catenin表达下调(P0.05),其培养液上清的VEGF浓度也有明显的下降(P0.05)。 结论下调PDGF-D的表达对胃癌细胞SGC-7901的体外增殖、粘附、迁移、侵袭、血管形成有明显抑制作用,其机制可能和PDGF-D下调后使核内的β-catenin表达下调进而使得其下游的Cyclin D1、MMP-2、MMP-9、VEGF蛋白表达下降有关。 第四部分RNA干扰PDGF-D表达对SGC-7901细胞裸鼠移植瘤生长和血管形成研究 目的观察下调胃癌SGC-7901的PDGF-D的表达对裸鼠移植瘤的生长和血管形成的影响。 方法通过裸鼠的移植瘤模型观察下调PDGF-D表达后胃癌细胞在裸鼠体内的生长情况,观测其对移植瘤生长的影响,Western Blot检测移植瘤内PDGF-D和VEGF的变化,检测组织微血管密度的变化。 结果发现PDGF-D下调的胃癌SGC-7901细胞裸鼠移植瘤生长缓慢,30天后检测体积明显较对照组小(P0.05),VEGF的表达下调,微血管密度较对照组明显下降(P0.05)。 结论下调PDGF-D可以抑制胃癌细胞裸鼠移植瘤的生长,其机制可能是通过下调VEGF的表达来抑制移植瘤的血管形成。


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