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反向杂交快速检测HBV基因型方法的建立及临床应用

赵丽  
【摘要】: 乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染后的临床转归和对抗病毒治疗的应答,随感染基因型的不同存在明显差异。中国大陆地区主要以B型和C型为主,其中北方以C型多见,南方以B型多见。另外在我国一些地区还存在少量的基因型A和D。目前检测HBV基因型的方法较多,但大都耗时费力,价格昂贵。 目的:建立一种简便快速准确检测HBV基因型的方法,利用该方法实现同时对HBV A~D 4种基因型的检测,探讨该方法用于临床检测HBV基因型的可行性。 方法:1.针对A、B、C和D型设计扩增引物和型特异性探针。上游引物在5'端进行地高辛修饰,探针两端进行多聚物加尾。选择经测序确定为HBV B型、C型的各1例慢性乙型肝炎患者血清标本,提取病毒DNA,通过TA克隆获得B、C型的标准株质粒;根据NCBI收录的HBV A、D、E~H型序列,将其分型探针和引物区域由公司合成,克隆在pMD18-T质粒载体上,构建A、D、E~H型的标准质粒株。通过巢式PCR扩增获得用于杂交的目的片段。 2.设计一系列优化实验,对探针载体、探针浓度及修饰、探针在载体上的固定、杂交条件、洗脱条件、抗体浓度以及显色方式进行优化,筛选出最佳反应条件,能特异灵敏的检测HBV基因型。 3.利用构建好的A~H型质粒评价方法的特异性和灵敏性。将B、C型质粒PCR产物按不同比例混合后杂交,评价该方法检测混合感染的能力。用该方法检测70例临床样本的HBV基因型,同时对这批样本的PCR产物直接测序分型,比较两种方法的一致性。 结果:1.成功构建了A~H 8种基因型的重组质粒株,选择序列保守区设计了扩增引物和针对A~D型的分型探针。 2.优化后最佳工艺反应条件为:选择带正电荷尼龙膜为探针载体;探针进行多聚dC加尾、浓度稀释成10μmol/L,采用紫外交联和高温烘烤的方式对探针固定;地高辛抗体稀释倍数1:10000;38℃杂交1h并在38℃用0.5×SSC/0.1%SDS严格洗脱15min;采用碱性磷酸酶催化NBT/BCIP的方式显色。 3.该方法特异性好,没有交叉反应。灵敏度可检测到拷贝数为103copy/ml或以上的样本,并可检测到含量为5%的混合型感染。对70例慢性乙型肝炎患者血清样品的HBV基因型检测,其中67例样本得以分型,另有3例样本因为PCR未能扩增出阳性条带,用本方法和测序法均未能对其进行分型。直接测序法与我们的方法检测结果基本一致,特异性达98.51%。重庆地区感染HBV主要以B型为主。 结论:我们成功建立了一种快速简便检测HBV基因型的方法。操作简单,适合临床上大规模推广使用,根据需要可以继续设计其他型特异性探针,达到对8种基因型的检测,具有广泛的应用前景。


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