超声微泡造影剂介导p53基因转染宫颈癌HeLa细胞的基础研究

【摘要】： 宫颈癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,其发病率仅次于乳腺癌而居第二位。其治疗方式主要包括:手术治疗、放疗、化疗、免疫治疗、热疗等。基因治疗是目前研究的热点,但基因载体问题是其发展的瓶颈。超声微泡造影剂作为一种新型的基因转染载体可实现安全、高效及靶向性的基因转染。本文通过体外实验研究超声微泡造影剂携带野生型p53基因转染宫颈癌HeLa细胞的转染效率并探讨wtp53基因对HeLa细胞的作用效果。 第一部分微泡浓度对HeLa细胞生长活性的影响 目的:探讨一定超声强度作用下,微泡浓度对HeLa细胞生长活性的影响,以期得到最优的超声微泡参数组合,为后续实验奠定基础。 方法:将HeLa细胞分为8个实验组,分别加入1%、5%、10%、20%的微泡浓度,每种微泡浓度分别给予0.5W/cm2,30s和0.75W/cm2,30s两种不同强度的超声辐照, MTT法检测不同超声微泡浓度对HeLa细胞生长活性的影响。 结果:超声辐照0.5 W/cm2,30s时,1%、5%、10%、20%的微泡浓度所对应的细胞存活率分别为(94.25±0.76)%、(86.78±0.87)%、(82.41±1.81)%、(62.72±1.71)%;超声辐照0.75 W/cm2,30s时,1%、5%、10%、20%的微泡浓度所对应的细胞存活率分别为(92.59±1.32)%、(84.00±0.69)%、(75.74±0.44)%、(59.35±0.58)%。 结论:超声微泡联合作用对HeLa细胞的增殖具有抑制作用,且随着微泡浓度的增大,超声强度的增加,对细胞的杀伤力明显增强。为了提高基因转染效率,在不明显影响细胞生长活性的前提下,我们选择0.5 W/cm2,30s的超声辐照,10%的微泡浓度作为后续基因转染实验的条件。 第二部分超声微泡介导p53基因转染HeLa细胞与传统转染方法效率的比较 目的:以第一部分所筛选出的超声微泡优化参数为实验条件,即0.5W/cm2,30s的超声辐照,10%微泡浓度,对宫颈癌HeLa细胞进行p53基因转染,并与传统的脂质体转染方法进行转染效率的比较。 方法:将HeLa细胞分为5组,以不同方法转染p53基因:A.质粒组;B.质粒+超声组;C.质粒+超声+微泡组;D.质粒+脂质体组;E.空白对照组。培养24-48h后,用荧光显微镜下细胞计数的方式比较各组的转染效率,RT-PCR对p53 mRNA表达进行半定量分析。 结果: 1.荧光显微镜下C组和D组均见较多明亮的绿色荧光细胞,两组转染率相比,C组高于D组,差异有统计学意义(P0.05),B组仅见极少量荧光细胞,A组和E组几乎见不到荧光细胞。 2. RT-PCR显示C组和D组可见明亮的特异性p53电泳条带,C组的p53/β-actin光密度比值较D组大,差异有统计学意义(P0.05),其余各组未检测到相应电泳条带。 结论:适当浓度的微泡造影剂联合优化的超声辐照可有效地介导外源性p53转染宫颈癌HeLa细胞,其转染效率高于传统的脂质体转染方法。超声微泡作为一种新型的转染载体,可实现较为高效的基因转染。 第三部分不同方式转染p53基因后对HeLa细胞生长活性的影响 目的:探讨采用不同方式转染wtp53基因后,对HeLa细胞生长活性的影响。 方法:将HeLa细胞分为5组,以不同方法进行wtp53基因转染:A.质粒组;B.质粒+超声组;C.质粒+超声+微泡组;D.质粒+脂质体组;E.空白对照组。培养24-48h后, MTT法检测HeLa细胞的增殖抑制情况,流式细胞仪检测细胞周期。 结果: 1. MTT检测显示转染后24、48、72、96 h,各组细胞的增殖均受到抑制,其中质粒+超声+微泡组细胞受抑制程度最明显,且随时间延长,抑制率逐渐增大。 2.流式细胞仪检测显示,与空白对照组相比,C组和D组进入G1期的细胞明显增多,G2期的细胞明显减少,差异具有统计学意义(P0.01,P0.05)。C组与D组两者相比,无显著性差异(P0.05)。 结论:转染wtp53对HeLa细胞生长具有较明显的抑制作用,超声微泡介导转染所引起的细胞增殖抑制程度最明显;质粒+超声+微泡、质粒+脂质体两种转染方式均可引起HeLa细胞的细胞周期出现明显的G1期阻滞,进而抑制了细胞的增殖。