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造血干细胞体内衰老模型的构建及相关生物学研究

杨斌  
【摘要】: 目的 生、老、病、死是生命的自然规律。衰老是机体发育成熟以后伴随着时间的推移体内各种细胞、组织与器官逐渐发生结构和功能不可逆转的、全面的衰退过程。最新研究认为:生物体的衰老实际上是其体内干细胞的衰老,所有的衰老现象包括组织器官退化、功能丧失、肿瘤发生和反复感染等都是成体干细胞衰老水平的具体表现。因此,深入研究干细胞衰老的机理对预防和治疗老年性疾病有重要理论意义与临床应用价值。 实验证明,造血干细胞(HSC)的衰老与机体衰老有着密切的关系。HSC衰老是指细胞生长停滞,不可逆的停留在G1期,自我更新和多向分化能力降低,细胞数量减少,应激性凋亡升高。HSC衰老可以引起机体造血功能和免疫功能的衰退、肿瘤发生率增加,并导致机体重要脏器结构与功能的衰退。目前对HSC衰老机理还了解甚少,如果能阐明HSC衰老的生物学机理,寻找到延缓其衰老途径,无疑对防治老年性疾病有重要的理论意义和临床应用价值。衰老模型的构建与相关生物学检测是研究HSC衰老机理的重要基础性工作,迄今仍未见理想和公认的HSC体内衰老模型。本研究以C57小鼠为研究对象,采用雄性供体HSC连续性移植建立小鼠的HSC复制性衰老的体内模型,并通过整体、细胞和分子水平对HSC衰老的生物学特性进行检测,旨在为研究HSC衰老机理以及延缓其衰老的途径提供理论与实验依据。 方法 1.免疫磁性分选法(MACS)分离、纯化雄性C57小鼠Sca-1+ HSC,流式细胞术(FCM)鉴定分选细胞纯度,免疫荧光检测分选HSC Sca-1+抗原的表达,台盼蓝拒染法检测分选Sca-1+HSC的活性。 2.用雄性供体HSC连续尾静脉移植给雌性受体鼠,建立小鼠HSC复制性衰老体内模型;经PCR分析Y染色体基因,鉴定受体鼠造血细胞是否来源于雄性供体;观察移植后受体鼠脾结节(CFU-S)形成数量、测定脾脏指数,胸腺指数,观察移植HSC后受体鼠外周血血象指标(WBC,RBC以及PLT)的恢复,以观察受体鼠造血功能重建情况。 3.采用造血祖细胞混合性集落(CFU-Mix)培养、细胞周期测定和衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β)染色,观察连续移植所致衰老HSC自我更新和多向分化能力的生物学特点。 结果: 1.小鼠Sca-1+HSC分离纯化及鉴定 流式细胞术检测MACS前骨髓单个核细胞(MNCs)中Sca-1+ HSC百分比仅为1.7%;MACS分离纯化后Sca-1+ HSC纯度可达87.2%以上。免疫荧光观察显示,分选前MNCs中仅有极少数细胞表达Sca-1+抗原,MACS分离纯化后标记的细胞中见大多数细胞表达Sca-1+抗原。台盼蓝拒染法检测分选的Sca-1+HSC活性为96%~99%。提示分选的Sca-1+细胞有较高纯度和活性。 2.供体HSC连续移植后受体鼠脾结节、脾脏指数、胸腺指数及外周血血象检测 2.1雄性供体HSC连续移植2次后,其在受体小鼠脾脏上形成CFU-S的能力下降。 2.2雄性供体HSC连续移植2次后,受体小鼠的脾脏和胸腺重量减轻,脾脏指数与胸腺指数皆有明显下降。 2.3雄性供体HSC连续移植2次后,受体小鼠WBC,RBC、PTC以及HCT均有所降低,提示在连续移植中HSC的自我更新及重建造血的能力下降。 3. Y染色体检测 经Y染色体PCR分析,结果显示受体鼠的造血细胞均能检测出342bp的Y染色体序列(Sry序列),证明雌性受体小鼠重建造血的细胞来源于雄性供体小鼠HSC。 4.连续移植所致HSC衰老的生物学检测 4.1随着HSC连续移植代数的增加,其形成CFU-Mix集落数量和形成集落的细胞数明显降低。 4.2随着HSC连续移植代数的增加,细胞出现G1期阻滞,其G0/G1期比例明显增高,S期比例减少。 4.3随着HSC连续移植代数的增加,SA-β-半乳糖苷酶阳性细胞百分比明显增高。 结论: 1.采用MACS能成功、有效的分离、纯化雄性C57小鼠Sca-1+ HSC,且细胞生物学活性良好。 2.雄性供体HSC移植能有效重建受体鼠造血功能。 3. Sca-1+ HSC连续尾静脉移植能有效建立造血干细胞复制性衰老的体内模型。


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