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线粒体ATP敏感钾通道对高氧诱导人肺泡上皮细胞凋亡的保护作用

邹新艳  
【摘要】:目的:探讨线粒体ATP敏感钾通道(mitochondrial ATP-sensitive potassium channel,mitoKATP)对高氧诱导人肺泡上皮细胞凋亡的保护作用。方法:以人肺泡上皮A549细胞为研究对象,体外传代培养A549细胞系。以3L/min的900ml/L氧气和50ml/L二氧化碳高纯混合气作为攻击因素处理A549细胞。实验将A549细胞共分为三组:对照组(n=8)、高氧组(n=8),二氮嗪组(n=8)。对照组:加入含100mL/L胎牛血清培养液常规培养;高氧组:加入等量含100mL/L胎牛血清培养液,换液后,通入3L/min的90%氧气和5%二氧化碳高纯混合气10min,密闭培养;二氮嗪组:用终浓度为100μmol/L的等量二氮嗪培养液预处理24h后,再用高氧诱导A549细胞,密闭培养12、24、48h收集细胞指标检测如下指标:倒置相差显微镜下观察A-549细胞的形态学改变并照相;CCK-8法检测A549细胞活力;流式细胞仪检测细胞凋亡;免疫组化法检测细胞内Omi/HtrA2的表达;激光共聚焦显微镜检测线粒体膜电位变化;透射电镜法检测细胞超微结构的变化。结果:(1)倒置显微镜下:对照组细胞贴壁良好,呈铺路石样,为扁圆的多角形,细胞排列紧密,连接成片,数量多,悬浮细胞少,分裂相多。高氧组细胞受损明显,形态改变,由典型的扁圆多角形细胞变为圆形或椭圆形,细胞间空隙加大,连接松散,活细胞数量明显降低,悬浮细胞明显增多;二氮嗪组细胞损伤状况明显得到改善,细胞生长状况明显好转,形态明显变好,较高氧组活细胞数量增加,悬浮细胞数减少,但未恢复到对照组水平;(2)与对照组(0.34±0.03)比,高氧组细胞活力(0.13±0.02)下降(P0.01);与高氧组相比,二氮嗪组细胞活力(0.21±0.04)增加,但未恢复至对照组水平(P0.01);(3)与对照组(0.40%±0.10%)比,高氧组凋亡率(6.54%±0.48%)明显增加(P0.01);与高氧组相比,二氮嗪组凋亡率(2.36%±0.51%)明显降低,差异有显著性p0.01)。(4)与对照组(15.26±2.80)相比,高氧组A549细胞内Omi/HtrA2的表达(44.94±4.47)明显增加,差异有显著性(P0.01);与高氧组相比,二氮嗪组Omi/HtrA2的表达(28.22±1.07)明显降低,差异有显著性(P0.01);(5)激光共聚焦显微镜下:与对照组(1.92±0.11)相比,高氧组细胞线粒体膜红/绿荧光强度比值(1.00±0.08)明显降低,差异有显著性(P0.01);与高氧组相比,二氮嗪组A549细胞线粒体膜红/绿荧光强度比值(1.57±0.08)增加,差异有统计学意义(P0.01)。(6)对照组A549细胞结构完整,胞核呈椭圆形,胞浆内可见大量多泡体,线粒体结构清晰,未见肿胀;高氧组胞核圆形,核仁明显,大量线粒体肿胀,电子密度减低,嵴减少;二氮嗪组可见细胞胞核小,圆形,胞质电子密度较高,线粒体呈空泡状,线粒体嵴减少。结论:二氮嗪可能通过稳定线粒体膜电位,减少Omi/HtrA2表达,从而减少A549细胞凋亡来明显减轻高氧诱导的人肺泡上皮细胞的损伤。


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