硝苦汤促进兔背部人粪污染创面愈合及其预防创面过度瘢痕化的实验研究

【摘要】：目的:观察中药复方硝苦汤外用对兔背部人粪污染手术创面愈合指数、成纤维细胞数量、毛细血管数量、TGF-β1蛋白含量和EGF蛋白含量的影响,验证硝苦汤外用促进痔瘘手术模型创面愈合及其预防创面过度瘢痕化的作用,探讨硝苦汤促进创面愈合和抑制创面过度瘢痕化的机理。方法:1.创面模型的制作与分组:新西兰大白兔16只,雌雄各半,电子秤称重,家兔两侧背部用8%硫化钠脱毛,再用25%乌拉坦(4ml/kg)麻醉。麻醉成功后在兔背中部脊柱两侧各旁开1.5cm,由前至后共各切割2个圆形全层皮肤创面,直径1.8cm,面积1.54cm2。充分止血后在创面上加粪液1ml(正常人新鲜粪便10g,加生理盐水5ml,混匀,离心,取上清液现配现用),以油纱,敷料,胶带固定,48小时后观察创面,参照文献见创面有脓性分泌物及有粪臭味者即为造模成功。将上述16只模型兔64个创面随机分为4组(每组16个创面):A组为空白对照组,B组为rhEGF治疗组,C组为中药硝苦汤组,D组为综合治疗组(中药+rhEGF)。2.给药:从造模成功后第二天开始给药。A组:每日涂生理盐水一次,再以敷料,胶带固定,每日换药一次,直至创面愈合。B组:均匀喷涂rhEGF(120AU/cm2)1次于创面上,余同A组。C组:涂硝苦汤40mg/cm2,余同A组。D组:均匀喷涂rhGF(120AU/cm2),30分钟后涂硝苦汤(40mg/cm2),余同A组。以上各组每次用药前半小时均在创面上涂粪液1ml,且每天用药前均常规清洁创面,同一时间换药1次。3.取材:于用药后第4,6,8,10,12,14,16,18天测量创面面积,计算出愈合指数,且各组于相同天数分别取1只动物共8只,麻醉(乌拉坦4ml/kg)成功后处死,用眼科手术剪分离创面新生肉芽组织,并成块取下,标本用10%中性福尔马林固定24小时后,用75%的酒精浸泡24小时,再将标本浸泡到70%的酒精中待检(进行成纤维细胞数量,毛细血管数量计数,EGF蛋白表达的检测)。剩下8只动物于愈合后第1,2,3,4,5,6,7,8天分别处死一只动物,用眼科手术剪分离创面瘢痕组织,并成块取下,用上法处理后待检(检测TGF-β1蛋白的表达)。4.检测:取出标本,石蜡包埋,分别进行HE染色,然后进行对照病理检测(成纤维细胞数量、毛细血管数量);同时进行即用型SABC法免疫组化染色(同一试剂盒),分别对各免疫组化切片进行TGF-β1、EGF蛋白表达检测,IPP图像分析软件分析,结果以平均灰度值表示。5.观察指标:①创面愈合指数(Healing index);②创面肉芽组织成纤维细胞数量(Fibroblasts number);③创面肉芽组织毛细血管数量(Capillary number);④创面肉芽组织EGF蛋白表达含量(f epidermal cell factor);⑤创面瘢痕组织TGF-β1蛋白表达含量(Transforming growth factor)。6.统计学方法:实验所得数据均以x±s表示,用t检验比较组间差异,P0.05被认为差异具有统计学意义。结果: 1.对创面愈合指数的影响:①硝苦汤组创面的平均愈合指数与生理盐水组比较(t=2.97, P0.05),差异有显著性,有统计学意义;与综合治疗组比较(t=2.19, P0.05),差异统计学意义;与rhEGF组比较(t=0.09,P0.05),差异无显著性,无统计学意义。②生理盐水组与rhEGF组比较(t=2.66, P0.05),差异有显著性,有统计学意义;与综合治疗组比较(t=4.36, P0.05),差异有统计学意义。③rhEGF组与综合治疗 组比较(t=2.20 P0.05),差异有显著性,有统计学意义。2.对成纤维细胞数量的影响:①硝苦汤组创面的平均成纤维细胞数量与生理盐水组比较,差异有显著性,有统计学意义(t=17.47, P0.001);与综合治疗组,差异有显著性,有统计学意义(t=2.67, P0.05);与rhEGF组比较,差异无显著性,无统计学意义(t=0.26,P0.05)。②生理盐水组与rhEGF组比较,差异有显著性,有统计学意义(t=18.06, P0.001);与综合治疗组比较,差异有显著性,有统计学意义(t=20.86,P0.05)。③rhEGF组与综合治疗组比较,差异有显著性,有统计学意义(t=2.32,P0.05)。3.对毛细血管数量的影响:①硝苦汤组创面的平均毛细血管数量与生理盐水组比较,差异有显著性,有统计学意义(t=7.84,P0.001);与综合治疗组,差异有显著性,有统计学意义(t=2.42,P0.05);与rhEGF组比较,差异无显著性,无统计学意义(t=0.29,P0.05)。②生理盐水组与rhEGF组比较,差异有显著性,有统计学意义(t=7.74,P0.001);与综合治疗组比较,差异有显著性,有统计学意义(t=10.37,P0.001);③rhEGF组与综合治疗组比较,差异有显著性,有统计学意义(t=2.75,P0.05)。4.各组肉芽组织EGF蛋白表达(灰度值)的变化:①苦汤组与生理盐水组比较,差异有显著性,有统计学意义(t=7.20,P0.001);与综合治疗组,差异有显著性,有统计学意义(t=2.34, P0.05);与rhEGF组比较,差异无显著性,无统计学意义(t=0.04,P0.05)。②生理盐水组与rhEGF组比较,差异有显著性,有统计学意义(t=7.38,P0.001);与综合治疗组比较,差异有显著性,有统计学意义(t=13.03,P0.001)。③rhEGF组与综合治疗组比较,差异有显著性,有统计学意义(t=2.36,P0.05)。5.对TGF-β1蛋白表达(灰度 值)的影响:①硝苦汤组与生理盐水组比较,差异有显著性,有统计学意义(t=7.30,P0.001);与综合治疗组,差异有显著性,有统计学意义(t=5.48,P0.001);与rhEGF组比较,差异无显著性,无统计学意义(t=10.29, P0.001)。②生理盐水组与rhEGF组比较,差异有显著性,有统计学意义(t=2.98,P0.001);与综合治疗组比较,差异有显著性,有统计学意义(t=0.29,P0.05)。③rhEGF组与综合治疗组比较,差异有显著性,有统计学意义(t=2.76,P0.05)。结论:1.本研究表明硝苦汤能够促进兔背部人粪污染手术创面的愈合;2.本实验证实硝苦汤能够预防兔背部人粪污染手术创面愈合后过度瘢痕化;3.实验结果显示硝苦汤促进创面愈合可能与促进创面EGF和TGF-β1的表达有关;4.硝苦汤抑制创面过度瘢痕化推测与抑制瘢痕组织中TGF-β1的表达有关;5.本研究提示硝苦汤和rhEGF联合应用更能促进兔背部人粪污染手术创面的愈合;6.本实验结果还提示中医药外用可促进痔瘘手术创面愈合和预防创面过度瘢痕化,并通过多种机制发挥治疗作用。