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脐血粒系祖细胞发育过程中Hoxb8的表达及干预研究

江南静  
【摘要】:目的:本课题主要探讨人类脐血造血干细胞(hematopoietic stem cell,HSC)向粒系(colony forming unit-granulocyte, CFU-G)发育过程中Hoxb8基因及蛋白的表达情况,用全反式维甲酸(all-trans-retinoic acid, ATRA)和/或三氧化二砷(arsenic trioxide, ATO, As2O3)进行干预,探讨ATRA与As2O3对脐血粒系祖细胞发育过程中Hoxb8表达的影响。方法:1.36例脐血标本由本院产房提供,取自正常足月顺产新生儿断脐后的胎盘段脐血。2.实验分组。实验分4组:(1)空白对照组(Normal):不加干预药物,代之等量DMEM/F12培养基加入基本培养体系。(2)ATRA组:加入ATRA稀释液,终浓度6×10-8mol/l。(3)As2O3组:加入As2O3稀释液,终浓度6×10-8mol/l。(4) ATRA+As2O3组:同时加入ATRA及As2O3稀释液,终浓度同上。3.采用造血干细胞体外培养技术,以ATRA和(或)As2O3持续干扰人类造血干细胞,观察正常组、ATRA组、As2O3组、ATRA+As2O3组的造血干细胞经人粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating, G-CSF)诱导后,在培养过程第3天,7天和12天的粒系祖细胞集落(colony forming unit-granulocyte,CFU-G)生成情况。4.采用瑞氏染色法鉴定粒系祖细胞集落成分。5.第3天、第7天、第12天分别提取各组细胞总RNA,用1%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA分子的完整性;并于第3天、第7天、第12天分别提取各组细胞的核蛋白,用BCA试剂盒测定各组样品的蛋白浓度。6.通过随机引物将总RNA逆转录为cDNA,采用实时荧光定量逆转录多聚酶链反应(fluorogenic quantitive reverse transcription polymerize chain reaction, FQ-RT-PCR)技术检测脐血粒系祖细胞增殖分化过程中各组HOXB8mRNA的表达;用Western-blot法检测各组样品的Hoxb8蛋白水平的表达。7.随机抽取逆转录的Hoxb8基因进行电泳分别获得Hoxb8基因在3天、7天、12天电泳图。将Hoxb8基因cDNA和人p-肌动蛋白(actin beta, ACTB)基因阳性产物cDNA梯度稀释制作各自的标准曲线,根据各个样本循环指数增长期的起始点即循环域值(cycle threshold,Ct)和标准曲线斜率计算各自样本起始cDNA模板量倍数值;以ACTB基因作为内参照进行标化;用化学发光法测定蛋白-抗体复合物的含量,在凝胶成像系统中成像并测量特异性条带表达强度,将同次电泳所得的Hoxb8和ACTB条带灰度值相比,得到各样本Hoxb8/ACTB的灰度比值,每组测3个样本。8.统计方法:结果用DNA相对拷贝数和RNA表达相对量(2-ΔΔCt)表示Hoxb8mRNA相对表达量,Hoxb8/ACTB的灰度比值表示Hoxb8蛋白的相对含量,采用均数加减标准差((?)±S)表示Hoxb8基因的变化情况。进行方差齐性检验,TOW-WAY AONVA方差分析,组间均数两两比较用LSD法,由统计学软件SPSS17.0完成。结果:1.集落细胞的形态学鉴定,瑞氏染色法证明所培养的细胞是粒细胞。2.1%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳显示RNA电泳图的5s,18s,28s三条带型整齐,无明显拖尾及弥散,说明RNA结构完整,无明显降解。3.逆转录PCR扩增各组均有目的基因Hoxb8和内参照ACTB基因的cDNA的产物,与DNA分子Marker相比示扩增产物大小分别为:Hoxb8为96bp,ACTB基因为lllbp,与预定理论值大小符合。4.人类造血干细胞向粒系祖细胞增殖分化过程中,Hoxb8mRNA及其蛋白第3天少量表达,第7天表达较强烈,第1.2天表达减弱;5.与正常对照组比较,6×10-8mol/L的ATRA能显著上调Hoxb8mRNA及其蛋白的表达,6×1O-8mol/L的As2O3对Hoxb8mRNA及其蛋白的表达无明显调节作用,6×10-8mol/L的ATRA和6×10-8mol/L的As2O3共同作用对Hoxb8mRNA及其蛋白的表达无明显调节作用。结论:1. Hoxb8mRNA及其蛋白在脐血粒系祖细胞增殖分化过程中表达,与粒系造血呈现一定的相关性。2.6×10-8mol/L的ATRA能显著上调Hoxb8mRNA及其蛋白的表达。3.6×10-8mol/L的As2O3对Hoxb8mRNA及其蛋白的表达无明显调节作用。4.6×10-8mol/L的ATRA和6×10-8mol/L的As2O3共同作用对Hoxb8mRNA及其蛋白的表达无明显调节作用。


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