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醋柳黄酮对高血压大鼠心血管重塑及血管舒缩功能的影响

高天林  
【摘要】:目的:观察腹主动脉缩窄高血压大鼠服用醋柳黄酮(TFH)治疗后对血管舒缩功能的影响;探讨TFH对高血压及其所致的心血管重塑的影响及机制。方法:(1)采用腹主动脉缩窄法制备高血压大鼠模型,随机分为4组(n=15):对照组(Control组饮用水10ml-kg-1);醋柳黄酮组(TFH组30 mg-kg-1);卡托普利组(CP组100 mg-kg-1); TFH+CP组(Com组TFH20 mg·kg-1和CP60 mg·kg-1),连续灌胃给药,每日1次,共6周;15只作为假手术组(Sham组)。(2)采用颈动脉插管术,利用Powerlab测量术前、术后1周,用药6周后颈动脉血压。(3)测量左心室重量、左室重量/体重(g/100g)比值:大鼠称重、麻醉后,立即摘取大鼠心脏,剪断肺静脉,从肺动脉瓣之上2mm处将肺动脉剪断,在心包的脏层转折处剪断主动脉和上、下腔静脉。取出心脏后用0.1mol.L-1、PH 7.4 PBS洗涤,滤纸吸干,称重;沿二尖瓣平面分离心房与心室,去右心室,称重。计算大鼠左室重量/体重(g/100g)比值。(4)大鼠心脏和胸主动脉病理观察,及胸主动脉中膜厚度测定:取大鼠左心室、胸主动脉,置4%甲醛固定,常规石蜡包埋、切片,HE染色,镜下观察。应用计算机分析测量图像软件IPP6.0统计,随机取每只大鼠5个血管断面,以血管壁中膜3、6、9、12点厚度平均值作为血管壁增厚的指标。(5)血清一氧化氮(NO)活性检测:右心室采静脉血6ml,高速离心后分离出血清,-20℃保存待用。待测血清用NO检测试剂盒,应用硝酸还原酶法检测血清NO活性。(6)对血管舒缩功能的影响:1)血管环制备及灌流:采血完毕,迅速剪下右肾动脉以上的胸主动脉,置于通以95%O2+5%CO2混合气体的Krebs溶液中,小心去除周围结缔组织后将血管剪成约4~5 mm宽的血管环。血管环插入两根直径200μm银丝做成的等腰三角形支架,其底边与血管环等长,其顶角穿入丝线结扎,移入10ml盛有Krebs液的37℃恒温浴槽,浴槽中持续充入含95%O2+5%CO2的混合气体。丝线一端固定于浴槽底部,一端连于张力传感器,传感器与放大装置相连,然后将信息输入电脑。操作过程中避免过度牵拉,以保护内皮的完整。用重酒石酸去甲肾上腺素(NE)10-6 mol·L-1检测离体胸主动脉环的活性,选择经NE10-6 mol·L-1处理后收缩的离体胸主动脉环,静息负荷为2g,平衡90 min,平衡期间每30 min更换Krebs液一次。2)实验方法:每次实验前,均预先用40 mmol·L-1KCl孵育最大收缩达平台后,用Krebs液进行洗脱六次。观察各组血管环:在亚最大收缩剂量(10-5mol·L-1)的NE预收缩最大张力达平台后,检测对乙酰胆碱(Ach)(3×10-7~10-4 mol·L-1)累积浓度的内皮依赖性舒张作用,以NE预收缩最大收缩幅度为100%,加入不同浓度Ach后的血管张力幅度与NE诱发最大收缩幅度之间的百分比反映内皮依赖性舒张的变化;左旋硝基精氨酸甲酯(L-NAME)(10-4 mol·L-1)孵育30分钟后,再用NE10-5 mol·L-1预收缩血管达稳态后,检测对Ach(3×10-7~10-4 mol·L-1)累积浓度的内皮依赖性舒张作用的影响;分别测定不同浓度NE(10-7~10-4 mol·L-1)时血管的收缩改变,诱导动脉环收缩反应的程度表示为40 mmol·L-1KCl最大收缩反应的百分比。(7)胸主动脉内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、核因子-KB(NF-KB)及左室心肌NF-KB免疫组化检测:胸主动脉及左室心肌经4%甲醛固定,石蜡包埋后切片(4μm),常规二甲苯脱蜡、梯度酒精水化后PBS冲洗,3%过氧化氢室温下孵育后,高压修复,在标本上滴加一抗,4℃湿盒中过夜,二抗孵育,DAB显色,苏木素复染,梯度酒精脱水、二甲苯透明后,中性树胶封片,置镜下观察和拍摄。另以PBS替代一抗作为阴性对照。实验步骤严格按照试剂盒说明书要求操作。采用IPP6.0分析测量图像软件测定阳性物质累积光密度(IOD)/测量组织面积所得的平均光密度值表示组织中相关蛋白表达的变化。(8)胸主动脉及心肌血管紧张素转化酶(ACE)测定:开胸腹取出心脏、胸主动脉于4℃生理盐水中冲洗两次,去除残血及结缔组织,-20℃保存待用。组织称重并剪碎分别加4—8倍的缓冲液(成份:0.05mol/L Tris,pH7.4,0.2%牛血清白蛋白,75mmoI /L NaCl,50gmol/L ZaS04),匀浆30秒×3,匀浆液在3900r/min(1800×g)离心15分钟×2,均弃上清,沉淀加缓冲液再悬浮,纱布过滤,滤液用来测定ACE的活性。实验步骤严格按照试剂盒说明书要求操作。450nm波长下测定OD值,根据标准品和样品的OD值,计算样本中ACE含量。结果:(1)TFH、CP能显著降低高血压大鼠收缩压、左室重量,左室重/体重比、主动脉中膜厚度、组织ACE活性(均P0.05),升高血NO水平(P0.05),且TFH和CP有协同作用。(2)免疫组化结果示:TFH、CP能显著升高高血压大鼠主动脉eNOS、iNOS表达(P0.01),降低组织NF-KB表达(P0.01),且TFH和CP有协同作用。(3)用药组大鼠内皮依赖性舒张反应较Control组显著增加(均P0.05),用药组之间无差异。NO合酶抑制剂L-NAME预处理后,对Ach诱发的舒张反应,Com组明显高于Control组(P0.05)。对NE诱发的收缩反应,Com组显著低于Control组(P0.05)。TFH组和CP组在NE浓度较低时收缩反应低于Control组(P0.05)。结论:(1)醋柳黄酮有确切的降压效果。(2)长期服用醋柳黄酮可以改善高血压大鼠血管内皮舒张功能,降低血管对缩血管物质的敏感性。(3)长期服用醋柳黄酮对高血压导致的心血管重塑有确切的逆转作用。(4)醋柳黄酮的心血管保护机制可能与改善血管内皮功能、增加一氧化氮合酶活性、刺激内皮源性NO增加,抑制血管紧张素转化酶,减少血管紧张素Ⅱ及其诱发的NF-KB炎症通路有关。(5)醋柳黄酮的心血管保护作用与卡托普利等效,两药联用具有协同作用,能更理想的控制血压、逆转心血管重塑。


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