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肺炎克雷伯氏菌的蛋白质组学分析

曾白华  
【摘要】:目的:超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)能水解几乎所有β-内酰胺酶类和单酰胺类抗生素,肺炎克雷伯氏菌是产ESBLs的主要细菌之一。产ESBLs细菌可通过垂直传播和水平传播把耐药基因传给非产酶细菌,从而极易引起院内感染的暴发流行。而目前由于缺乏有效的早期鉴定ESBLs的方法,使得控制该菌的院内感染极为困难。为此探索一种简单、快速、准确的早期鉴定ESBLs方法有着积极重要的作用。表面增强激光解析电离飞行时间质谱技术(SELDI-TOF-MS)是当今最前沿,敏感度及特异度都很高的检测技术。本研究采用差异蛋白组学的方法,利用SELDI-TOF-MS技术检测肺炎克雷伯氏菌产ESBLs株和不产ESBLs株蛋白指纹图谱,结合决策树和聚类分析,建立产酶株的诊断模型,探索其用于产ESBLs细菌的早期鉴定和同源性分析方面的临床价值。 方法:1. ESBLs仪器初筛实验(screening test):使用walkaway-96全自动细菌药敏鉴定仪对临床分离的肺炎克雷伯氏菌进行20种常见抗生素敏感实验,凡头孢他啶、头孢噻肟、头孢曲松、氨曲南、头孢泊肟中有三种或三种以上显示耐药,仪器提示这些细菌为产ESBLs可疑菌株,应进一步做ESBLs确证实验。2. ESBLs表型确证实验(confirmatory test):对初筛可疑产ESBLs菌株采用抗菌药物头孢他啶/克拉维酸(30μg/10μg)与头孢他啶抑菌圈差值,头孢噻肟/克拉维酸(30μg/10μg)与头孢噻肟抑菌圈直径差值来判断,当二种抗菌素中任何一种加克拉维酸后抑菌圈直径与不加克拉维酸的抑菌圈相比,增大值≥5mm时,判定为ESBLs阳性。以上两种试验均用肺炎克雷伯氏菌ATCC700603做质量控制。3.细菌蛋白质谱分析:对确证产ESBLs的菌株和不产ESBLs的肺炎克雷伯氏菌通过先破坏细菌、提取蛋白质,再用SELDI-TOF-MS技术及Au蛋白芯片自动检测细菌蛋白质指纹图谱。4.数据分析:对检测的细菌蛋白质图谱用Biomarker Wizard3.1软件进行分析,筛选肺炎克雷伯氏菌ESBLs阳性菌株和ESBLs阴性菌株相关差异表达蛋白,建立肺炎克雷伯氏菌ESBLs阳性菌株决策树诊断模型;用SPSS对肺炎克雷伯氏菌进行聚类分析,追溯其临床感染的同源性。 结果:1.对walkaway-96仪器初筛产ESBLs的33株肺炎克雷伯氏菌通过纸片法表型确证实验确证有32株细菌ESBLs阳性(准确率为96.97%),这些ESBLs阳性菌株主要分离自痰,其次是尿,患者以新生儿和60岁以上的老年人为主。2.32株确证产ESBLs和17株不产ESBLs的肺炎克雷伯氏菌在相对分子量为2000-20000范围内共检测到47个蛋白质峰,产酶株和不产酶株有显著性差异的蛋白峰共11个(P〈0.01)。3.用三个质荷比分别为5993.25,8363.60,9215.26的蛋白质峰建立的肺炎克雷伯氏菌产ESBLs菌株决策树诊断模型能够区分肺炎克雷伯氏菌产酶菌株和不产酶菌株,测试组准确率为100%,验证组准确率为90.90%。4.32株确证产ESBLs肺炎克雷伯氏菌质谱指纹图通过聚类分析,结果在差异水平为10的情况下分为五型(A型、B型、C型、D型、E型),以B型为主,A型次之,再其次是C型和E型,D型最少,每型又分为2-3个亚型。 结论: 1.肺炎克雷伯氏菌产ESBLs菌株有特征性的蛋白质指纹图谱。 2.建立了肺炎克雷伯氏菌产ESBLs菌株的决策树诊断模型。以质荷比为5993.25,8363.60,9215.26建立的诊断模型经交叉验证和盲法检测均显示出较好的灵敏度和特异度。 3.肺炎克雷伯氏菌产ESBLs菌株的决策树诊断模型的建立,开辟了ESBLs鉴定的新方法。与传统ESBLs细菌检测方法相比,SELDI-TOF-MS技术在鉴定ESBLs菌株方面具有简单、快速和准确的优势,适合推广。 4.通过SELDI-TOF-MS质谱结果聚类分析能够对细菌进行分型,判断细菌亲缘关系远近,追溯其蛋白质分子同源性,为临床流行病学检测提供依据。 5.本研究结果提示SELDI-TOF-Ms技术平台应用于临床细菌蛋白质同源性分析的可行性。


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