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三氧化二砷诱导白血病细胞凋亡的差异蛋白质组学研究

王丽  
【摘要】:目的:观察不同浓度三氧化二砷(As_2O_3,Arsenic trioxide)对人急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)细胞系HL-60细胞的凋亡诱导作用及干预前后HL-60细胞的差异蛋白表达,通过对部分差异蛋白功能的搜库,探讨As_2O_3诱导HL-60细胞凋亡的作用机制,为临床应用三氧化二砷治疗白血病提供实验依据。方法:1.采用HL-60细胞株作为白血病细胞模型。2.分组及干预:实验共设六组,实验组加入终浓度分别为0.1、1、2、4、8umol/L的As_2O_3,以不加药物组为对照组。每组设三个重复孔,采用肿瘤细胞体外培养技术培养72h。3.采用瑞式染色法鉴定细胞及观察As_2O_3对HL-60细胞凋亡形态学的影响。4.采用流式细胞术检测在不同浓度As_2O_3干预下HL-60细胞凋亡发生情况。5.采用高效液相色谱分离技术及QEXACTIVE质谱分析技术寻找处理前后的差异蛋白:5.1培养72h后分别提取三氧化二砷干预前后细胞总蛋白。5.2BRADFORD法对提取蛋白定量,SDS-PAGE胶电泳再次定量确认。5.3蛋白相对定量准确,溶液内酶解。5.4质谱分析5.5生物信息学分析6.统计方法:所有数据资料进行方差齐性检验,用SPSS16.0软件进行统计分析,若P0.05差异即具有统计学意义。结果:1.瑞氏染色结果表明实验所培养细胞为粒细胞,细胞凋亡随着药物浓度增加而越来越明显,在倒置光学显微镜下观察不仅可见到胞浆量减少、细胞体积变小、染色质向核膜靠近、还可见到部分细胞胞膜有伪足样突起、细胞内出现凋亡小体以及核固缩、核碎裂等典型的细胞凋亡形态学变化。2.流式细胞术检测结果表明,HL-60细胞的凋亡随着As_2O_3浓度的增加而增加,与对照组相比,均有统计学差异。3.质谱鉴定及搜库结果显示有102个蛋白在干预前后出现高表达或低表达。其中聚腺苷二磷酸核糖聚合酶[poly(ADP-ribose)polylxletase,PARP],ATP酶(ATPase)以及EF-2(Elongation factor2)等的高表达或低表达在As_2O_3诱导HL-60细胞凋亡过程中起到促进作用,为临床应用三氧化二砷治疗白血病奠定基础。结论:本实验应用瑞士染色,流式细胞术以及高效液相色谱分离技术及QEXACTIVE质谱分析技术证明了三氧化二砷As_2O_3对HL-60细胞的凋亡诱导作用呈浓度依赖性增强。查找出102个凋亡相关蛋白,对其中部分蛋白功能进行搜库,这些蛋白的高表达或低表达对HL-60细胞的凋亡均起到诱导作用,为研究HL-60细胞的凋亡机制奠定了基础。


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