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应用SELDI-TOF MS质谱技术构建临床常见病原菌蛋白指纹数据库

张航烽  
【摘要】:目的:分析临床常见病原菌SELDI-TOF MS蛋白指纹图谱,筛选稳定表达蛋白标志物,建立9种细菌蛋白指纹数据库,运用临床菌株对数据库的鉴定能力进行验证,为细菌感染的快速诊断奠定基础。方法:1.收集四川省人民医院2012年5月至2012年9月临床分离经全自动微生物分析仪鉴定的菌株。2.扩增16S rRNA基因对细菌进行分子生物学鉴定。3.通过不同点样孔和不同Au芯片上多次重复检测同一株细菌蛋白,分析其蛋白指纹图谱差异,评价质谱仪和芯片检测细菌蛋白的重复性。4.比较3株参考菌株在不同培养基中蛋白指纹图谱差异,分析不同培养基对细菌蛋白指纹图谱的影响。5.比较细菌蛋白指纹图谱在不同培养时间下的差异,分析培养时间对细菌蛋白图谱的影响。6.比较同种细菌不同株之间蛋白指纹图谱差异,验证同种细菌蛋白表达的稳定性。7.比较不同种细菌蛋白指纹图谱差异,分析其差异。8.将收集的菌株分为建模组和验证组:临床分离细菌147株与7株参考菌株设为建模组,其余378株临床分离菌株为验证组。分别检测其蛋白表达,分析蛋白指纹图谱;筛选出建模组中9种细菌各自稳定表达的蛋白峰,将数据导入自建的Fingerwave软件,构建细菌蛋白指纹数据库。9.将378株验证组细菌的蛋白峰数据导入Fingerwave软件与蛋白指纹数据库进行相似度比较,对蛋白指纹库的鉴定能力进行验证。 结果:1.收集临床9种细菌525株,包括表皮葡萄球菌38株,鲍曼不动杆菌54株,大肠杆菌123株,肺炎克雷伯菌99株,粪肠球菌22株,金黄色葡萄球菌50株,铜绿假单胞菌83株,屎肠球菌22株和阴沟肠杆菌34株。2.实验菌株16S rRNA测序结果与GenBank中该菌株基因序列一致性均≥98%,鉴定为相应的细菌。3.分析同株细菌蛋白指纹图谱,其主要蛋白峰在孔间和芯片间分子量变异系数均≤0.05%。4.比较不同培养基上生长的同株菌蛋白指纹图谱,显示在不同培养媒介其细菌特征蛋白恒定表达。5.不同培养时间对细菌蛋白表达影响很小,其蛋白指纹图谱共有蛋白峰分子量变异系数均≤0.2%。6.同种细菌不同株之间蛋白指纹图谱共有蛋白峰分子量变异系数均≤0.5%,细菌蛋白表达稳定。7.在分子量3000-20000Da范围内,临床常见9种细菌有各自特异的蛋白指纹图谱。8.筛选出9种细菌蛋白指纹图谱各自稳定表达的蛋白峰,初步建立临床常见9种病原菌的蛋白指纹数据库。9.将验证组菌株蛋白指纹数据与建立的蛋白指纹数据库进行比对,鉴定结果的符合率分别为表皮葡萄球菌95.0%(19/20)、鲍曼不动杆菌85.3%(29/34)、大肠埃希菌96.2%(101/105)、粪肠球菌100%(11/11)、肺炎克雷伯菌88.8%(71/80)、铜绿假单胞菌90.5%(57/63)、金黄色葡萄球菌97.5%(39/40)、屎肠球菌81.8%(9/11)和阴沟肠杆菌85.7%(12/14)。 结论:利用SELDI-TOF MS技术检测细菌蛋白结合自建Fingerwave软件建立的蛋白指纹数据库进行蛋白指纹数据相似度比较,可同时对9种常见临床病原菌进行鉴定,为临床病原菌的快速诊断提供了可能。


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