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齐墩果酸对血管紧张素Ⅱ诱导乳小鼠心肌成纤维细胞增殖的影响及其机制

王志琴  
【摘要】:目的:探索齐墩果酸(Oleanolic acid,OA)对血管紧张素II(angiotensinII,AngII)诱导乳小鼠心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts,cFs)增殖的影响,并探讨可能存在的机制。方法:1、乳小鼠心肌成纤维细胞的培养与鉴定:取乳小鼠,经手术取其心脏心室,酶消化差速贴壁法培养,特异性抗体荧光免疫法鉴别cFs。2、观察OA对cFs增殖活性的影响:实验分组:①正常对照组(0μm);②OA(10μm)组;③OA(20μm)组;④OA(40μm)组;⑤OA(60μm)组;⑥OA(80μm);⑦OA(100μm)组;分别于12h、24h、48h、72h、96h四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT)检测细胞增殖情况。3、观察AngII对cFs增殖的影响:实验分组:①正常对照组(0mol/L);②AngII(10-5mol/L)组;③AngII(10-6 mol/L)组;④AngII(10-7 mol/L)组;⑤AngII(10-8 mol/L)组,分别于24h、48h、72h、96h采用MTT检测细胞增殖活性情况。4、观察OA对AngII诱导cFs增殖的影响:将cFs预先用AngII处理后备用,实验分组为:①正常对照组;②AngII(10-7mol/L)组;③AngII(10-7mol/L)+OA(50μm)组;④AngII(10-7mol/L)+OA(50μm)+ZnppIX(10μm,HO-1酶活性阻断剂),孵育36h,MTT检测细胞增殖活性,荧光定量RT-PCR检测①②③组细胞中Nrf2、HO-1mRNA的表达。5、有效慢病毒的筛选:实验分组为:①正常对照组、②Nrf2干扰慢病毒组、③空病毒组,孵育96h,荧光显色法直接观察GPF显色以及荧光定量RT-PCR法检测细胞内Nrf2表达量。6、检测OA对AngII诱导经Nrf2干扰慢病毒感染的cFs内Nrf2、HO-1 mRNA的表达:经病毒感染后的cFs用AngII预处理备用,实验分组:①正常对照组;②Ang II(10-7mol/L)组;③AngII(10-7mol/L)+OA(50μm)组;④OA(50μm)+AngII(10-7mol/L)+空病毒组;⑤OA(50μm)+AngII(10-7mol/L)+Nrf2干扰慢病毒组。MTT检测细胞增殖活性情况,荧光定量RT-PCR检测细胞内Nrf2、HO-1的mRNA的表达量。结果:(1)10-100μm浓度的OA对正常cFs活性无明显影响;(2)10-8、10-7、10-6、10-5mol/L浓度的AngII均可促进cFs增殖,且存在浓度时间依赖性,在10-7mol/L浓度24h时AngII的增殖效应最强。(3)OA能显著抑制AngII诱导的乳小鼠cFs的增殖作用,并促进细胞内的Nrf2、HO-1mRNA量的表达,当加入ZnPPIX后OA的抑制作用显著减弱。(4)荧光显微镜及定量RT-PCR检测显示Nrf2干扰慢病毒成功感染cFs,感染率约79%。(5)Nrf2的表达被干扰后OA抑制AngII诱导的cFs增殖效应显著减弱,细胞内HO-1mRNA的表达量显著减少。结论:(1)OA能抑制AngII诱导cFs的增殖,并促进细胞内Nrf2、HO-1mRNA的表达。(2)核转录因子Nrf2参与了OA在cFs中HO-1mRNA的表达调控。(3)OA通过调控HO-1的表达抑制AngII诱导乳小鼠cFs的增殖作用。本研究显示,OA可能通过激活乳小鼠cFs内Nrf2的核转录,促进HO-1的mRNA表达,从而减轻AngII诱导的乳小鼠cFs增殖作用。


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