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甘露糖化咪唑化羧甲基壳聚糖与依替膦酸复合物纳米粒在动物体内抗肿瘤效应的初步研究

黄燕  
【摘要】:目的:本研究采用皮下种植H22肝癌细胞的方法制作Balb/c小鼠肿瘤模型,并采用免疫组化法观察模型小鼠中肿瘤组织的TAMS聚集情况。前期研究中已发现的甘露糖化壳聚糖纳米粒具有与甘露糖受体特异性结合的能力,在本研究初步了解纳米药物在小鼠体内的安全剂量,评价该纳米药物在模型小鼠的组织分布、对模型小鼠的抑瘤效果,进一步在细胞水平探讨该纳米颗粒抗肿瘤的作用机制。方法:1、模型小鼠的制作:将H22肝癌细胞注入balb/c小鼠腹腔,取腹水离心后生理盐水重悬1×10~7/ml,移植于小鼠左侧腹股沟皮下,每只0.2ml,皮下形成肿瘤的小鼠即为模型小鼠。2、模型小鼠癌巢周围巨噬细胞聚集情况:采用免疫组化染色方法,用CD68抗体、CD163抗体分别标记肿瘤病灶的肿瘤相关巨噬细胞TAMS、M2型巨噬细胞,在光学显微镜观察肿瘤组织阳性染色细胞的聚集情况。3、纳米药物的安全剂量实验:设计三个梯度的纳米药物实验组,尾静脉注射纳米药物浓度分别为:1g/kg、500mg/kg、200mg/kg,生理盐水组为对照组,给药后7天内记录小鼠的有无死亡,观察小鼠的饮食、活动及体重变化情况,评价安全性,寻找后期实验的用药剂量。4、纳米药物在模型小鼠体内的组织分布:模型小鼠分别在尾静脉推入纳米药物后3小时、24小时、72小时剖出心、肝、脾、肺、肾、肿瘤,行快速冰冻切片,通过荧光显微镜观察组织中荧光强弱并记录荧光值。5、纳米药物的抑瘤实验:实验设计高、中、低浓度纳米药物实验组(MICE),生理盐水组和空白纳米组做为阴性对照组,干扰素组为阳性对照组,移植后第二天予不同药物处理,在用药后21天内记录各组小鼠肿瘤生长的体积变化。实验结束,剖检各组剩余小鼠的肿瘤,称重和测量体积,并计算各组小鼠的肿瘤体积抑制率和肿瘤质量抑制率。重复实验,记录在用药后30天内各组小鼠的存活数量。6、纳米药物对癌巢中免疫细胞影响:实验设计了纳米药物组、干扰素组、空白纳米颗粒组、生理盐水组,移植后第二天予不同药物处理,皮下种植模型后15天实验结束,眼底静脉采血并剖出小鼠的肿瘤组织,肿瘤组织用机械法制作单个细胞,通过流式细胞仪检测静脉血和肿瘤组织中CTL、Treg、M1、M2型巨噬细胞的比例。结果:1、小鼠在皮下种植后第8天,扪及有肿瘤形成,表明模型建立成功。2、肿瘤免疫组化结果:肿瘤实质和间质均有TAMS和M2型巨噬细胞聚集,其中肿瘤间质聚集的TAMS、M2型巨噬细胞多于肿瘤实质。3、动物的药物安全剂量实验结果:在7天的观察期间,三个浓度梯度的纳米药物实验组的一般情况可,未观察到明显药物毒性。剖检实验组和对照组小鼠的重要脏器,脏器的颜色、形态均无明显差别,药物的安全性较好,提示后期实验的用药剂量在1g/kg以内。4、纳米药物在模型小鼠的组织分布结果:心脏在用药后3小时、24小时、72小时和空白对照组的荧光值相近,无统计学意义。用药后3小时的肝、脾、肺、肾、肿瘤平均荧光值均大于对应的空白对照组(P0.01);用药后24小时,只有肝、肾、肿瘤的平均荧光值高于空白对照组(P0.01);用药后72小时,仅肿瘤的平均荧光值高于空白对照组(P0.01)。5、纳米药物的抑瘤实验结果:高浓度纳米组的成瘤时间晚于其他五组,成瘤后各组小鼠肿瘤体积变化有明显差异,其中高浓度纳米组瘤体生长缓慢,其余五组肿瘤生长速度较快。实验结束时,高浓度组肿瘤体积明显小于其他五组(P0.01)。高浓度纳米组的肿瘤体积抑制率和肿瘤质量抑制率较高,可达到80%以上;其他五组的肿瘤体积抑制率和肿瘤质量抑制率相差不大,均低于30%。实验期间,高浓度纳米组零死亡,其他组均出现模型小鼠死亡事件,提示高浓度纳米药物对肿瘤的抑制效果明显。6、流式细胞仪检测结果:肿瘤组织检测结果:与生理盐水组对比,纳米药物组的免疫抑制性细胞M2和Treg比例下降,免疫增强的细胞M1和CTL细胞比例升高。干扰素组的免疫抑制性细胞Treg和M2比例升高,免疫增强的细胞CTL细胞比例升高、M1降低;空白纳米组与生理盐水的免疫细胞比例相近。静脉血检测结果:与生理盐水组对比,纳米药物组的免疫抑制性细胞Treg比例升高、M2相近,免疫增强的细胞M1和CTL比例升高;干扰素组的免疫抑制性细胞Treg比例升高、M2相近,免疫增强的细胞M1和CTL比例升高;空白纳米组的免疫抑制性细胞Treg比例升高、M2相近,免疫增强的细胞CTL比例升高、M1降低。结论:1、模型小鼠肿瘤组织中聚集有大量的TAMS、M2型巨噬细胞,具备肿瘤免疫治疗的动物模型条件;2、纳米药物的安全剂量范围至少在1g/kg以内;3、纳米药物能够靶向聚集到肿瘤组织,且维持时间较长;4、高浓度纳米药物(500mg/kg)对肿瘤生长有明显的抑制效果;5、纳米药物发挥抗肿瘤效应的作用机制,可能与免疫细胞M2型巨噬细胞、Treg细胞比例下降,CTL、M1型巨噬细胞比例升高有关。


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