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高毒力肺炎克雷伯菌生物标志的鉴定研究及基因组学分析

唐敏  
【摘要】:目的:筛选鉴定高毒力肺炎克雷伯菌(hypervirulent Klebsiella pneumoniae,hvKP)的生物标志,为临床识别高毒力肺炎克雷伯菌提供实验室依据;采用全基因组测序技术,从基因组水平进一步分析肺炎克雷伯菌在毒力和耐药等方面的生物特征,为肺炎克雷伯菌的分子致病机制研究奠定基础。方法:收集某医科大学附属医院2016年10月至2018年9月临床分离的非重复肺炎克雷伯菌151株。采用MicroScan WalkAway 96 plus全自动细菌鉴定/药敏分析仪及基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOF MS)进行菌株鉴定;查询菌株所属患者的临床资料;采用不同浓度的肺炎克雷伯菌感染大蜡螟,建立大蜡螟感染模型,进行肺炎克雷伯菌毒力检测;采用MicroScan WalkAway 96 plus全自动细菌鉴定/药敏分析系统对菌株进行药敏试验,亚胺培南、美罗培南用K-B法进行复核;应用黏液丝试验检测肺炎克雷伯菌高黏液表型情况;采用PCR方法检测肺炎克雷伯菌常见的6种荚膜血清型(K1、K2、K5、K20、K54、K57)和11种毒力基因(prmpA、wcaG、aerobaction、mrkD、entB、ybtS、fimH、iutA、terB、prmpA_2、iucA);配制CAS双层琼脂蓝色培养基检测肺炎克雷伯菌产铁载体;应用肠杆菌科基因间重复一致序列(ERIC-PCR)对菌株进行同源性分析;通过前述实验筛选出肺炎克雷伯菌Kpn472、Kpn1031和Kpn1050,进行全基因组测序,对原始数据进行组装获得基因组序列;采用Glimmer软件进行基因预测,结合GO和KEGG数据库进行基因功能注释,并进行三株菌在毒力、耐药以及分泌系统等致病系统的差异分析。结果:结合临床资料和大蜡螟感染模型毒力检测试验,151株肺炎克雷伯菌中筛选出65株高毒力肺炎克雷伯菌,86株经典型肺炎克雷伯菌(classic Klebsiella pneumoniae,cKP)。药敏结果显示,除哌拉西林、头孢西丁、妥布霉素、哌拉西林/他唑巴坦、亚胺培南、美罗培南外,hvKP对常用抗菌药物的耐药率均低于cKP。毒力基因aerobaction、prmpA、iucA、prmpA_2鉴定高毒力肺炎克雷伯菌,其准确度均大于95%。黏液丝试验结果显示,65株hvKP中黏液丝试验阳性50株,86株cKP中黏液丝试验阳性7株,其准确度为85.43%。6种荚膜血清型k1/k2/k5/k20/k54/k57联合检测,其准确度提高至91.39%。CAS双层琼脂蓝色培养基检测铁载体,在鉴定hvKP中其准确度为90.72%。ERIC-PCR DNA指纹图谱结果显示hvKP和cKP均呈现多样性。基因组测序结果显示,Kpn472基因组序列大小为5640618bp,GC含量为57.20%;Kpn1031基因组序列大小为5817945bp,GC含量为57.04%;Kpn1050基因组序列大小为5687489bp,GC含量为57.19%。基因预测发现Kpn472含有5180个编码基因,83个tRNA和2个5S rRNA;Kpn1031含有5429个编码基因,83个tRNA,5个5S rRNA;Kpn1050含有5840个编码基因,80个tRNA,1个23S rRNA,5个5S rRNA。GO和KEGG注释结果显示,3株菌在参与编码分子功能和代谢方面基因较多。Kpn472和Kpn1031菌株携带铁摄取系统相关毒力基因相对于Kpn1050较高;毒力基因aerobactin存在于两株高毒力菌株中,而在经典型菌株中并未存在。耐碳青霉烯类菌株Kpn1031和Kpn1050均携带bla_(KPC-2)耐药基因。Kpn472携带分泌系统相关基因有48个,Kpn1031有46个,Kpn1050有47个,主要涉及到II型、VI型和Sec-SRP分泌系统。结论:1.基因aerobaction、prmpA、iucA和prmpA_2有望成为高毒力肺炎克雷伯菌鉴定的生物标志。2.采用CAS双层琼脂蓝色培养基检测铁载体,可为无PCR实验室的基层医院识别hvKP提供方法。3.aerobaction基因在高毒力肺炎克雷伯菌的毒力方面起着重要作用。4.两株耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌菌株均携带bla_(KPC-2)耐药基因。


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