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RNA干扰技术沉默STAT3基因对人肺腺癌A549细胞的生长抑制作用的研究

孙绍娟  
【摘要】:目的:探讨RNA干扰技术沉默STAT3基因对人肺腺癌A549细胞的生长抑制作用。方法:①以STAT3 mRNA全基因序列作为模板,根据siRNA的设计原则,从基因编码区起始密码子下游寻找符合设计特征的靶序列–针对STAT3基因编码区989-1007与2144-2162核苷酸碱基序列,用BLAST软件进行同源分析证实为STAT3高度保守、与人类其它基因无同源性后,采用化学合成法合成四条寡核苷酸链。设计的寡核苷酸序列5'端和3'端分别含BglII和HindIII酶切位点,5'端开始为19个核苷酸的siRNA作用链序列,中间以9个核苷酸的TTCAAGAGA间隔形成发夹结构,最后为siRNA作用序列的反向重复序列,3'末端加有转录终止信号TTTTT。②取等量的正负链DNA合成片段,退火得到目的双链DNA(dsDNA)。含RNA聚合酶Ⅲ与U6启动子的真核表达质粒pSUPER经限制性内切酶BglII和HindIII双酶切,暴露BglII和HindIII酶切位点,可直接用于与制备好的目的基因连接。将纯化的双链DNA片段定向克隆到经BglII和HindIII酶双酶切的真核表达质粒pSUPER的多克隆位点,利用重组DNA技术构建含目的基因的重组质粒pSUPER–siRNA–STAT3。以常规方法制备感受态宿主E. coli DH5α,并将连接产物转化感受态细菌。将菌液涂布于含氨苄青霉素(终浓度60μg/ml)的固体LB培养板上,倒置于37℃温箱中孵育过夜。连接成功的重组体能在抗性培养板上生成单菌落,随机挑取生长良好的数个单菌落于含有适量氨苄青霉素的LB液体培养基3ml中,置于37℃摇床中250rpm过夜。以小量质粒抽提试剂提取扩增后的重组质粒,即得到目的表达载体pSUPER。经PCR初步筛选并进行DNA测序分析加以确定,证实能在体内转录针对STAT3基因转录体的发夹状siRNA的表达载体pSUPER–siRNA–STAT3构建成功。③采用脂质体介导方法,将重组质粒和脂质体按20:1的比例共转染肺腺癌A549细胞。同时设立空质粒对照组及空白对照组。分别于转染24小时、48小时、72小时收集细胞。


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