1，25（OH）_2D_3对TGF-β_1诱导的人肾小管上皮细胞转分化的干预效应及其机制的研究

【摘要】： 目的：肾小管间质纤维化是各种慢性肾脏疾病发展到终末期肾功能衰竭的共同途径。肾小管上皮细胞-间充质细胞转分化(Tubular epithelial-mesenchymal transition, TEMT)在肾小管间质纤维化的进展中起着重要作用。转化生长因子β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1被认为是致肾脏纤维化最重要的作用因子之一,可以促进TEMT的发生。Smads蛋白是TGF-p信号转导过程中最重要的胞内效应因子之一,它能将TGF-p信号由胞膜转入核内。Smad3过度表达及Smad7被抑制是肾脏纤维化的主要原因。1,25-二羟维生素D(1,25-dihydroxyvitamin D3,1,25(OH)2D3)是体内最重要的维生素D活性产物,通过与其受体-维生素D受体(vitamin D receptor, VDR)结合发挥生物学效应。已有研究表明1,25(OH)2D3可以改善肾脏纤维化,但尚未有关其改善TEMT分子机制的报道。本实验通过检测1,25(OH)2D3对TGF-β1诱导人肾小管上皮细胞转分化过程中的E-钙粘蛋白(E-Cadherin, E-Cad)、α-平滑肌肌动蛋白(a-smooth muscle actin,α-SMA)、VDR、Smad3、Smad7蛋白及mRNA的动态表达变化,探讨1,25(OH)2D3对TGF-β1诱导人肾小管上皮细胞转分化的干预效应及其分子机制,为临床肾脏纤维化的药物治疗提供更多的理论依据。方法：体外培养正常人肾小管上皮细胞(HK-2细胞株)。将细胞随机分为5组：正常对照组(N)、TGF-β1(5ng／ml)组(T)、TGF-β1(5ng／ml)+1,25(OH)2D3(10-9mol／L)组(D1)、TGF-β1(5ng／ml)+1,25(OH)2D3(10-8mol／L)组(D2)、TGF-β1(5ng／ml)+1,25(OH)2D3(10-7mol／L)组(D3)。每组设三复孔,分别于加入干预因素后12h、24h、48h、72h,使用倒置显微镜观察细胞形态学变化,免疫组化法和Real-time PCR法检测α-SMA、E-cadherin、VDR、Smad3、Smad7蛋白及mRNA的表达变化。结果：(1)与正常对照组相比,在12h、24h、48h、72h,TGF-β1(5ng／ml)诱导组细胞形态发生改变,从原有典型的铺路石样上皮细胞形态转变为长梭形类似成纤维细胞的形态,且呈时间依赖关系；免疫细胞化学结果提示a-SMA、Smad3蛋白的表达随时间明显增加(P＜0.05), E-cadherin、VDR. Smad7蛋白的表达则随时间逐渐减少(P0.05)；Realtime-PCR结果示a-SMA、Smad3、Smad7 mRNA的表达随时间明显增加(P0.05), E-cadherin、VDR mRNA的表达则随时间逐渐减少(P0.05)。(2)与TGF-β1(5ng／ml)诱导组相比,除D1组在培养12h和24h后仍可见大部分HK-2细胞呈成纤维细胞样形态外,其余各1,25(OH)2D3干预组均不同程度的抑制了TGF-β1诱导的细胞形态学改变；免疫细胞化学结果同样显示除D1组在培养12h和24h后a-SMA、E-cadherin、VDR、Smad3、Smad7蛋白表达与TGF-β1(5ng/ml)诱导组相比没有统计学意义(P0.05)外,其余各1,25(OH)2D3干预组a-SMA、Smad3蛋白的表达下调(P0.05),呈剂量依赖关系,E-cadherin、VDR、Smad7蛋白的表达则明显上调(P0.05),亦呈剂量依赖关系；Real time-PCR结果则同免疫细胞化学结果一致。结论：(1)1,25(OH)2D3对TGF-β1诱导的人肾小管上皮细胞转分化有一定的抑制作用,且呈剂量依赖关系。(2)1,25(OH)2D3对TGF-β1诱导的人肾小管上皮细胞转分化的抑制作用可能与其上调VDR、Smad7的表达,下调Smad3的表达有关。