鸦胆子内生真菌及其活性菌株的研究

【摘要】：近年来,随着农林产业结构的调整,毁林开荒种植经济果林活动日益频繁,药用植物资源日益枯竭,从药用化合物的传统来源(如植物)中获得有效化合物变得越来越困难,而植物内生真菌可以产生与宿主相同或相似的生物活性物质,且生长速度快、易工业化生产,因此,从药用植物内生真菌中获取有效化学成分日益受到人们的关注。本研究对广西南宁市郊老虎岭野生鸦胆子的内生真菌进行了系统的研究,主要涉及高活性拮抗菌株的分离、筛选、鉴定,发酵工艺优化、胞外挥发性物质的抑菌活性研究以及胞内抑菌成分分离鉴定等研究,取得主要研究结果如下： (1)鸦胆子内生真菌的分离和活性菌株的筛选。 从鸦胆子的根、茎、叶和果实器官共分离到83株内生真菌菌株,其中茎部得到34株内生真菌；叶部得到32株内生真菌；根部得到18株内生真菌；果实部分得到2株内生真菌。已鉴定的73株内生真菌分属于5目6科12属。活性试验结果：14株内生真菌对1种以上植物病原真菌有拮抗活性；9株内生真菌的代谢产物对至少1种以上细菌有抑制作用。其中,YJ-17菌株对多种植物病原菌的抑菌活性较强。 (2)YJ-17菌株的菌种鉴定。 通过BLAST分析YJ-17菌株的28S rRNA序列。同源性检索发现,YJ-17菌株与NCBI数据库中的其它拟茎点霉属真菌最接近,相似性为≥98%。在系统发育树中,YJ-17菌株与多株拟茎点霉属真菌在同一分支上。根据经典的菌丝体、菌落、载孢体以及甲乙两种分生孢子等的形态学特征观察,结合相关文献的描述,以及28S rRNA序列分析判定YJ-17菌株为拟茎点霉属真菌(Phomopsis sp.)。而目前苦木科鸦胆子属植物上的拟茎点霉的ITS序列均无登录,也未见相关文献对苦木科鸦胆子属的拟茎点霉进行过描述和报道,而与报道的臭椿属两种拟茎点霉在甲型分生孢子形态、大小方面有显著差异,故初步判断YJ-17菌株为一新菌种,拟将其命名为鸦胆子拟茎点霉(Phomopsis bruceae Z.N.LiangK.P.Lai, sp. nov。 (3)YJ-17菌株发酵工艺优化 通过Box-Behnken响应面试验,拟合出YJ-17菌株菌丝干重与玉米粉等各营养因子的二次回归模型,并推算出各营养因子的较佳水平值,具体为玉米粉35.5g.L-1、葡萄糖16.8g.L-1、硝酸钾1.61g·L-1、无机盐1.58g.L-1。依据回归模型得出响应值的最大预测值为Y1=1.58g。将优化培养基配方与原始发酵培养基相比,YJ-17菌株菌丝生长量增长了48.45%。另通过此试验,获得温度等各自变量的较佳水平值,其分别为温度26.2℃、发酵时间131.8h、接种量0.02.2%。根据回归模型解算出响应值的最大预测值为Y1=1.58g。把优化发酵条件与原始发酵条件相比,YJ-17菌株菌丝体干重达到了1.54g,增长了16.29%。 (4)YJ-17菌株挥发性物质的抑菌效果和成分鉴定 YJ-17菌株挥发物对14种植物病原菌的抑制作用结果显示YJ-17菌株挥发物对柑桔青霉、香蕉弯孢霉叶斑病菌、水稻纹枯病均具有很好的杀菌活性,达70%以上。活性炭对YJ-17菌株挥发性物质的抑菌作用有影响,其可以吸附YJ-17菌株挥发性物质的部分组分,以致挥发物的抑菌活性减弱,但部分未被吸附的挥发物仍然起抑菌作用,使得病原菌菌丝的生长及色素的生成受抑制。对YJ-17菌株所产挥发性物质进行了部分鉴定,其中3-环己烯-1-醇的百分含量最大,分别具杀虫、抑菌、消炎等作用的有β-水芹烯、萜品醇和侧柏酮等。 (5)YJ-17菌株胞内成分的分离、纯化和鉴定 YJ-17菌株的胞内成分,经过提取、硅胶柱层析、重结晶等分离方法,得到7个单体化合物。通过1H-NMR、13C-NMR、DEPT和EI-MS波谱技术分析,对这7种单体化合物进行了结构解析。得出以下物质：(Ⅰ)3β-羟基-5α,8α-过氧化麦角甾-6,22-二烯,(Ⅱ)5α,8α-环二氧-24(s)-甲基麦角甾-6,22-二烯-3β-醇,(Ⅲ)麦角甾7,22-二烯-3β-醇,(Ⅳ)麦角甾5,7,22-三烯-3β-醇。