丹参注射液对CYP450酶的抑制作用研究及和厚朴酚在大鼠小肠组织中代谢产物的结构鉴定

【摘要】：药物代谢是药物发现和开发中不可或缺的一部分,分为体内代谢研究和体外代谢研究。体外代谢通过探究药物在主要I相代谢酶细胞色素CYP450酶的代谢特性,预测化合物在生物体内发生代谢转化的早期信息,为药物潜在的代谢性相互作用提供依据。体内代谢研究的重要部分代谢产物鉴定分析主要通过液质联用技术等确征药物在生物体内的代谢产物,揭示其在体内的代谢转化过程以及排泄途径。本论文分为两部分,分别通过体外实验探究了丹参注射液对CYP450酶的抑制作用,及体内实验研究了和厚朴酚在大鼠小肠组织中代谢产物的结构鉴定。丹参注射液为丹参提取物制成的水溶性制剂,含丹参素、原儿茶酸、原儿茶醛、丹酚酸A及B等多种成分。由于其在心脑血管疾病方面的突出疗效,临床上广泛与多种药物的连用日益增多,但丹参注射液对CYP450酶作用的研究报道相对较少。因此,本研究第一部分采用探针药物法就丹参注射液对大鼠肝微粒体5种CYP450亚型酶(CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4)的影响进行探讨,采用超高效液相色谱串联三重四级杆质谱法(UPLC-MS/MS)建立肝微粒体孵育体系中探针底物代谢产物的检测方法,并对其进行了系统的方法学验证。结果显示所建立的分析方法专属性强、线性范围宽,灵敏度、准确度高,重复性好,满足生物样品分析方法的一般准则,可用于目标化合物的定量分析。结果显示丹参注射液对大鼠CYP1A2,CYP3A4的工C50值100μg/mL,对CYP2C9,CYP2C19和CYP2D6的IC50值分别是 3.32μg/mL,16.44μg/mL,0.30μg/mL。丹参注射液对大鼠CYP1A2, CYP3A4没有抑制作用,对CYP2C9具有中等抑制作用,对CYP2C19具有弱抑制作用,对CYP2D6表现出强抑制作用。在发现丹参注射剂对大鼠肝微粒体酶CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6呈现出不同程度的抑制作用后,为比较其种属差异,进一步研究其对人肝微粒体酶的影响,继续采用探针药物法考察丹参注射液对人肝微粒体酶CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6的影响,结果显示丹参注射液对人CYP2C9, CYP2C19和CYP2D6的IC50值50μg/mL,没有表现出抑制作用。因此,丹参注射液在临床上与经CYP2C9, CYP2C19,尤其是CYP2D6代谢的药物联合应用时应特别注意,以防止和经CYP2C9, CYP2C19和CYP2D6代谢的药物发生代谢性相互作用。本论文第二部分主要研究和厚朴酚的体内代谢特性。和厚朴酚是从中药厚朴中分离出的天然小分子活性物质,具有广泛的抗肿瘤活性。小肠作为重要的肝外代谢器官,其对药物的代谢作用同样重要。本文采用稳定性同位素标记与超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF-MS/MS)联用技术,鉴定分析大鼠小肠中和厚朴酚的代谢产物。最终,在小肠组织中共发现了20个代谢产物,这20个代谢产物全部是二相代谢产物,分别是12个氨基酸结合物、4个硫酸盐结合物、4个葡萄糖醛酸结合物,其中8个代谢产物为首次发现。为系统理解和厚朴酚在体内的代谢转化途径提供了依据。并对大鼠粪便、血浆、小肠中的代谢产物进行综合分析,比较三种生物样品中和厚朴酚的代谢产物的种类和数量的差异,为深入探讨和厚朴酚在体内的代谢产物类型,及其体内代谢途径提供了参考。