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基于PI3K/AKT/mTOR信号通路研究补肾活血法修复雷公藤多苷致卵泡发育障碍的分子机制

陆柳如  
【摘要】:实验一、大鼠卵巢颗粒细胞的体外培养及鉴定目的:在前期研究的基础上,分离大鼠卵巢颗粒细胞进行原代培养,并探索其增殖高峰期,为下一步实验确定最佳检测时间点。方法:将雌性成年SD大鼠皮下注射孕马血清促性腺激素(PMSG) 40IU,48h后将大鼠以颈椎脱臼法处死,迅速剖取卵巢放入PBS液中冲洗,用空针针头刺破卵泡,释放卵泡内颗粒细胞,吹打分散后过滤,离心后弃上清液,收集细胞,细胞培养瓶中加入DMEM/F12/青链霉素/胎牛血清培养液,于37℃、5%CO2培养箱中培养,24h后换液,将培养24h贴壁的大鼠卵巢颗粒细胞分为5组:空白对照组、雷公藤多苷组、西药组(雷公藤多苷+戊酸雌二醇)、中药高剂量组(雷公藤多苷+新加归肾丸高剂量)、中药低剂量组(雷公藤多苷+新加归肾丸低剂量)。空白对照组给予等量生理盐水灌胃大鼠获取的血清,其余四组先加入80mg/kg·d雷公藤多苷大鼠含药血清作用48小时后,再分别加入各组含药血清,48小时后,进行HE染色及FSHR免疫细胞化学法进行颗粒细胞鉴定。MTT法检测各组颗粒细胞培养第48h、72h、96h、120h、144h的生长、增殖及凋亡情况。结果:HE染色结果:HE染色后在镜下见贴壁细胞形态完整,边缘清晰,呈不规则多角形,细胞核呈卵圆形染深蓝色,胞浆淡红色,判定为颗粒细胞。FSHR结果:FSHR特异表达于卵巢颗粒细胞,免疫细胞化学染色见阴性细胞中,只有细胞核被染成蓝紫色,细胞浆无色;阳性细胞的细胞浆呈棕黄色,细胞核呈蓝紫色,判定为颗粒细胞,FSHR阳性率90%。MTT结果:培养48h后,颗粒细胞聚集生长,呈梭状,核大而圆。加大鼠血清后,颗粒细胞继续聚集生长,呈梭状,核大而圆。在96h~120h之间,细胞增长速度最快,120h时细胞OD值到达峰值。120h后,细胞生长速度减慢,形态异常的数量增多,死亡细胞逐渐增多。结论:1、本实验中大鼠卵巢颗粒细胞的分离及原代培养是成功的,且可以满足后续实验的需要。2、本实验中体外培养96h-120h的大鼠卵巢颗粒细胞增殖速度最快,120h的OD值达峰值,后续实验可以收集此时间点的颗粒细胞进行各项指标的检测。实验二、基于PI3K/AKT/mTOR信号通路研究补肾活血法修复雷公藤多苷致卵泡发育障碍的分子机制目的:在实验一的基础上,以原代培养的大鼠卵巢颗粒细胞为实验对象,以与卵泡发育密切相关的PI3K/AKT/mTOR信号通路为切入点,研究雷公藤多苷抑制卵泡发育及补肾活血复方新加归肾丸促进卵泡发育的分子机制。方法:参照实验一方法分离及培养大鼠卵巢颗粒细胞,将培养24h贴壁的大鼠卵巢颗粒细胞分为5组:空白对照组、雷公藤多苷组、西药组(雷公藤多苷+戊酸雌二醇)、中药高剂量组(雷公藤多苷+高剂量新加归肾丸)、中药低剂量组(雷公藤多苷+低剂量新加归肾丸)。空白对照组给予等量生理盐水灌胃大鼠获取的血清,其余四组先加入80mg/kg·d雷公藤多苷大鼠含药血清作用48小时后,再分别加入各组含药血清,48小时后,用MTT法检测各组细胞的增殖率,用蛋白免疫印迹法(western-blotting)检测颗粒细胞中PI3K/AKT/mTOR信号通路上的主要信号分子PI3K、p-AKT、p-mTOR以及上游分子IGF-1及IRS-1的蛋白相对表达量,用实时荧光定量法(RT-PCR)检测颗粒细胞中PI3KmRNA、p-AKTmRNA、 p-mTORmRNA、IGF-1mRNA及IRS-1mRNA的相对表达量。结果:MTT法检测结果显示:与空白对照组相比,各组的光密度值均降低,其中尤其以雷公藤多苷组下降最多,差异均具有统计学意义(P0.01);与雷公藤多苷组相比较,西药组及中药各剂量组光密度值均升高,差异具有统计学意义(P0.01或P0.05);与西药对照组相比,中药高剂量组光密度值差异无统计学意义(P0.05),中药低剂量组光密度值降低,差异具有统计学意义(P0.05)。Western-blotting及RT-PCR检测结果显示:与空白对照组相比,雷公藤多苷组颗粒细胞中的PI3K、p-AKT、p-mTOR、IGF-1、IRS-1蛋白及mRNA的相对表达量均降低,差异具有统计学意义(P0.01);应用戊酸雌二醇及不同剂量的新加归肾丸大鼠含药血清作用48h后,与雷公藤多苷组相比,西药组、中药高剂量组颗粒细胞上的PI3K、p-AKT、p-mTOR、IGF-1、IRS-1蛋白及mRNA的相对表达量及中药低剂量组PI3KmRNA、p-mTOR蛋白、IRS-1蛋白相对表达量均上升,差异具有统计学意义(P0.01或P0.05),中药低剂量组颗粒细胞上的P13K蛋白、p-AKT蛋白及mRNA、p-mTORmRNA. IGF-1蛋白及mRNA、IRS-1蛋白及mRNA相对表达量与雷公藤多苷组的差异无统计学意义(P0.05),但有上升趋势;与西药组相比,中药高、低剂量组颗粒细胞上的P13K蛋白及mRNA中药高剂量组p-AKT蛋白及mRNA.中药高剂量组p-mTOR蛋白及mRNA、中药高剂量组IGF-1蛋白及mRNA、中药低剂量组IGF-1蛋白、中药高剂量组IRS-1蛋白及mRNA、中药低剂量组IRS-1 mRNA的相对表达量的差异均无统计学意义(P0.05),中药低剂量组p-AKT及p-mTOR蛋白及mRNA.中药低剂量组IGF-1mRNA、中药低剂量组IRS-1蛋白相对表达量的差异具有统计学意义(P0.01或P0.05)。结论:1、雷公藤多苷可能通过下调大鼠卵巢颗粒细胞PI3K/AKT/mTOR信号通路中相关信号分子PI3K、p-AKT、p-mTOR及上游细胞因子IGF-1与IRS-1的表达,抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路的活性,使大鼠卵巢颗粒细胞有丝分裂信号传递受阻,抑制颗粒细胞增殖,导致卵泡生长发育受阻。2、补肾活血中药复方新加归肾丸可能通过上调大鼠卵巢颗粒细胞PI3K/AKT/ mTOR信号通路中相关信号分子PI3K、p-AKT、p-mTOR及上游细胞因子IGF-1、IRS-1的表达,增强PI3K/AKT/mTOR信号通路的活性,加快大鼠卵巢颗粒细胞有丝分裂信号的传递,促进颗粒细胞增殖,进一步促进卵泡的生长发育。


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