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补阳还五汤对博莱霉素所致大鼠特发性肺纤维化的保护作用及机制研究

杨昆  
【摘要】:目的:基于促纤维化生成的关键介质HMGB1探讨补阳还五汤治疗博来霉素致大鼠特发性肺纤维化药效学作用机制。方法:1.采用体重200±20g的SD雄性大鼠144只随机分为空白对照组、模型组、强的松组、补阳还五汤高、中、低剂量组,每组24只。除空白组外其余各组均采用一次性气管注射博来霉素法诱导肺纤维化模型。造模后24h给予相应药物,各组分别于第7、14、28天随机抽取8只大鼠进行股动脉放血处死,收集支气管肺泡灌洗液(Broncho alveolar fluid, BALF)和肺组织,采用HE、Masson染色法观察肺组织肺泡炎、纤维化程度,酶联免疫法(ELISA法)检测肺泡灌洗液中早期炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6和晚期炎性因子HMGB1的水平,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR法)检测肺组织IMGB1、TLR2mRNA的表达,Western-blot法检测肺组织中HMGB1、α-SMA的含量,免疫组化染色法(链霉素亲和素一过氧化物酶,SABC法)检测肺组织切片HMGB1、α-SMA蛋白的分布及表达。2.从中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心购置A549,培养传至第三代后分别根据实验需要种于不同的培养皿中,收集对数生长期细胞用于实验。加入以DMEM/F12培养液稀释的补阳还五汤溶液,加入HMGB1蛋白刺激培养24h收获上清,分装后予-80℃冻存备用;条件一致,加入以DMEM/F12培养液稀释的补阳还五汤溶液,加入HMGB1蛋白分别于刺激0、6、24、72h提取细胞总蛋白。Western-blot法检测A549细胞蛋白中STAT3、P-STAT3的表达。结果:1 一般情况:空白组大鼠形体壮硕,反应灵敏,皮毛光滑柔顺,食量正常。模型组大鼠表现出精神萎靡,眼光呆滞,反应迟钝,呼吸喘促,个别口鼻出现红色分泌物,少动,皮毛干枯无光泽,弓背蜷缩,进食量较正常组减少,体重增长缓慢。其余各给药组大鼠精神较好,反应较为灵敏,呼吸较平稳,皮毛光泽度良好。随时间的推进,活动量、进食量下降等程度均有不同程度的改善。2病理形态学:①HE染色:空白对照组大鼠肺组织结构清晰,未见明显形态学改变;与空白对照组相比,模型组大鼠的肺泡结构均有不同程度的破坏,有炎性细胞的浸润和胶原纤维的增生;与模型组相比,各给药组的肺泡炎及肺纤维化程度在不同时间点均有不同程度的改善。②Masson染色空白组组大鼠支气管壁胶原层较薄,肺泡区有少量染成浅蓝色的胶原纤维分布。模型组大鼠第7d肺泡间明显增宽,在支气管壁、血管壁以及肺泡间隔均可见染成蓝色的胶原纤维;第14d各级支气管及血管外壁、增厚的肺泡隔内均可见蓝色胶原纤维;第28d在细支气管、低血管外膜和纤维化实变区可见大量蓝色胶原纤维增生,弥漫性肺纤维化生成。强的松组与补阳还五汤各剂量组均能减轻肺纤维化。3 TNF-α、IL-1β、IL-6、HMGB1的含量:①TNF-α:与空白组比较,各时间点模型组大鼠肺泡灌洗液中(BALF)中TNF-α含量升高(P0.05)。在28天TNF-α含量下降,与7、14天比较差异具有显著性(P0.05);与模型组比较,各时间点强的松组和补阳还五汤高、中、低剂量组均降低大鼠肺泡灌洗液中(BALF)中TNF-α含量(P0.05);与强的松组比较,第7、14天补阳还五汤各剂量组有明显差异(P0.05);补阳还五汤各剂量组之间比较,各时间点高剂量组与低、中剂量组之间有差异(P0.05)②IL-1β:与空白组比较,各时间点模型组大鼠肺泡灌洗液中(BALF)中IL-1β含量升高(P0.05)。其IL-1 β含量呈进行性降低趋势,实验的第7天达到高峰,以后逐渐下降,但仍然处于较高水平。与模型组比较,各时间点强的松组和补阳还五汤高、中、低均降低大鼠肺泡灌洗液中(BALF)中IL-1β含量(P0.05);与强的松组相比,第7天补阳还五汤高、中、低剂量组具有显著性差异(P0.05),与强的松组相比,第14、28天补阳还五汤各剂量组无明显差异(P0.05)。补阳还五汤各剂量组之间无明显差异(P0.05)③IL-6:空白组比较,模型组大鼠肺泡灌洗液中(BALF)中IL-6含量升高(P0.05)。模型组各时间点比较,第14、28天与第7天比有差异(P0.05),其IL-6含量呈进行性降低趋势。与模型组比较,各时间点强的松组和补阳还五汤高、中、低均降低大鼠肺泡灌洗液中(B ALF)中IL-6含量(P0.05);与强的松组相比,第7天高、中、低剂量组具有显著性差异(P0.05)。第14、28天补阳还五汤各剂量组无明显差异(P0.05)。补阳还五汤各剂量组之间比较无明显差异(P0.05)④HMGB1:与空白组比较,各时间点模型组大鼠肺泡灌洗液中(BALF)中HMGB1含量升高(P0.05),模型组各时间点之间比较,无明显差异(P0.05);与模型组比较,各时间点强的松组和补阳还五汤高、中、低均降低大鼠肺泡灌洗液中(BALF)中HMGB1含量(P0.05);与强的松组相比,在第7、14、28天补阳还五汤各剂量组均有明显差异(P0.05)。4 HMGB1、α-SMA的表达:CDHMGB1表达与空白组比较,各时间点模型组大鼠肺组织HMGB1的表达升高(P0.01)。模型组各个时间点比较,无明显差异(P0.05);与模型组比较,强的松组和补阳还五汤高、中、低在各个时间点均降低肺组织HMGB1的过度表达(P0.05);与强的松组相比,第7、14、28天补阳还五汤各剂量组均有明显差异(P0.05)。②a-SMA的表达与空白组比较,各时间点模型组大鼠肺组织a-SMA的表达升高(P0.01)。模型组各个时间点比较无明显差异(P0.05)。与模型组比较,各时间点强的松组和补阳还五汤高、中、低均降低肺组织a-SMA的过度表达(P0.05);与强的松组相比,第28天补阳还五汤各剂量组有明显差异(P0.05)。5 HMGB1、TLR2mRNA的表达:①MGB1mRNA的表达空白组内各时间点HMGB1mRNA的表达无明显差异(P0.05),与空白组比较,各时间点模型组大鼠肺组织HMGB1mRNA的表达升高(P0.05),模型组各个时间点比较,无明显差异(P0.05);与模型组比较,各时间点强的松组和补阳还五汤高、中、低均降低肺组织IMGB1mRNA的过度表达(P0.05);与强的松组相比,在第14、28天补阳还五汤各剂量组有明显差异(P0.05);(2)TLR2mRNA的表达空白组内各时间点TLR2mRNA的表达无明显差异(P0.05),与空白组比较,各时间点模型组大鼠肺组织TLR2mRNA的表达升高(P0.05);模型组各个时间点之间比较无明显差异(P0.05);与模型组比较,强的松组和补阳还五汤高、中、低均降低肺组织TLR2mRNA的过度表达(P0.05);补阳还五汤各剂量组与强的松组相比无明显差异(P0.05)。6 STAT3、P-STAT3的表达:与正常组比较,在HMGB1刺激下STAT3、P-STAT3的表达明显升高(P0.05);与模型组比较,20%补阳还五汤含药血清能够抑制A549 STAT3、P-STAT3的表达(P0.05)。结论:1.补阳还五汤能够改善BLM所致特发性肺纤维化大鼠的肺泡炎和肺纤维化瘢痕形成。2.补阳还五汤能够降低BLM所致的特发性肺纤维化大鼠支气管肺泡灌洗液炎性指标TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、HMGB1的浓度值,这可能是其发挥抗IPF作用的机制之一。3.补阳还五汤能够有效抑制肺组织HMGB1、TLR2mRNA的表达,补阳还五汤能够抑制肺组织HMGB1、α-SMA蛋白的表达,补阳还五汤含药血清能够抑制STAT3、P-STAT3的表达,证实补阳还五汤能够发挥较好的抗肺纤维化作用与其调控HMGB1信号通路有关,HMGB1可能是促纤维化生成的关键介质。


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