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芪灯明目胶囊有效成分对高糖条件下Dll4/Notch-VEGF信号通路的调控作用及其抗血管生成机制的研究

高娜  
【摘要】:目前,Delta-Notch信号通路尤其是其配体Delta-like ligand 4(Dll4),被认为是调节新生血管发生的另一个重要机制,VEGF和Notch信号通路在多方面相互作用,在肿瘤血管的研究中发现联合抑制VEGF和Notch信号通路可协同抑制肿瘤生长。Notch信号通路有望成为针对新生血管形成的又一新药物靶点,为糖尿病视网膜病变的治疗提供新方向。中医中药防治糖尿病相关并发症已取得重要进展,不管是中药单体有效成分,还是中药复方,其实验及临床研究均揭示了中医中药在治疗糖尿病视网膜病变方面的显著优势。芪灯明目胶囊是以本团队为研发主力而开发的治疗DR的中药成果之一。芪灯明目胶囊采用葛根素、黄芪甲苷、野黄芩素三种有效成分组成,分别从中药原材料即葛根,黄芪,灯盏花中提取。目前关于中药提取物的研究主要涉及氧化应激反应和自由基、炎症反应细胞因子、糖基化终末产物等,但是由于中医药有效成分的多样性和DR发病机制的复杂性,大部分的中药提取物的药物作用靶点还未完全明确。本课题立足于Dll4/Notch-VEGF信号通路,研究中药有效成分复方制剂芪灯明目胶囊的潜在药物作用靶点,有力于优化药物设计,提高中医药对于优势病种的临床疗效,同时由点到面,进一步阐明中医中药对于眼部及全身新生血管性疾病的潜在作用,进而推广中医中药的临床应用范围。第一部人脐静脉内皮细胞高糖模型的建立目的:由于细胞模型的易操作性及易重复性,使得高糖刺激下的细胞模型广泛用于中医药防治糖尿病视网膜病变的研究中。但相关文献中关于如何选择和建立高糖培养下的内皮细胞模型还鲜有报道。如何建立最能模拟人体实际体内环境下的细胞模型是本部分实验的研究目的。方法:采用MTT比色法检测细胞增殖能力,同时测定细胞代谢的实时葡萄糖浓度,即间接反映细胞在高糖培养模式下的代谢活性,综合两者筛选出高糖细胞模型的最佳高糖浓度及观测时间点。结果:与正常对照组相比,培养液中葡萄糖浓度为30mmol/L和40mmol/L的细胞活性从24h开始下降,40mmol/L组细胞在培养早期细胞未贴壁者比例较高,且其活性下降较30mmol/L高糖细胞更剧烈;此外,各高糖组细胞上清液中葡萄糖浓度随时间延长均有不同程度的降低,30mmol/L和40mmol/l的高糖组葡萄糖浓度降低值在48h和72h处减小,结合以上,认为30mmol/L高糖浓度培养下的HUCEVs可作为体外DR细胞模型。同时,为排除随高糖作用时间增长,代谢产物本身对细胞产生的毒性作用,在该浓度刺激下作用48h是观察药物干预作用的最佳观测点。第二部分芪灯明目胶囊有效成分对高糖条件下细胞活性和迁移的影响目的:采用有效药物干预可降低高糖环境对细胞活性的毒性作用,减少细胞凋亡,降低新生血管发生率。同时,高糖环境下内皮细胞迁移能力发生变化,由于内皮细胞迁移是新生血管形成的关键步骤,故评价药物对细胞迁移的影响有助于了解药物抗血管生成作用。方法:采用两种干预途径,即Notch信号通路抑制剂(γ-分泌酶抑制剂,DAPT)和芪灯明目胶囊有效成分(葛根素,黄芪甲苷,野黄芩素)分别作用于高糖细胞模型,通过检查细胞活性比较两者对细胞的保护作用,通过Transwell法观察药物对细胞迁移的影响。结果:DAPT和芪灯明目胶囊三种有效成分均能在特定浓度范围内能保护高糖环境下内皮细胞活性,降低高糖对细胞的损害作用。同时,高糖环境下内皮细胞迁移增加,但DAPT和芪灯明目胶囊三种有效成分均能部分抑制高糖诱导的内皮细胞迁移。第三部分芪灯明目胶囊有效成分对高糖条件下Dll4/Notch-VEGF信号通路的作用目的:目前关于Notch信号通路中关键信号分子在DR新生血管形成中的作用机制研究较少。Notch信号通路在尖细胞的出芽中起主要介导作用,且与VEGF信号通路信号相互协调,因此抑制Notch信号通路具有抑制新生血管形成的作用。第二部分实验结果表明芪灯明目胶囊有效成分能部分抑制高糖条件下细胞的迁移,那么这种抑制效应是否通过Dll4/Notch-VEGF信号通路上相关信号分子的调控来实现呢?所以我们针对中药干预后,该信号通路上主要信号分子Dll4,Notch1,Notch4,VEGF,VEGFR1,VEGFR2,Ephrin B4,Eph B4的表达情况,来探讨中药抑制血管生成的机制与Dll4/Notch-VEGF信号通路的相互关系。方法:设立正常对照组细胞、高糖(HG)细胞组,DAPT+HG细胞,葛根素+HG细胞,黄芪甲苷+HG细胞,野黄芩素+HG细胞组,分别采用实时定量PCT测量各组Dll4,Notch1,Notch4,VEGF,VEGFR1,VEGFR2,Ephrin B4,Eph B4的基因表达,同时Western Blot法验证Dll4,Notch1,Notch4,VEGF的蛋白水平。结果:与正常对照组相比,高糖组细胞(30mmol/L葡萄糖浓度)中的Dll4、Notch1、VEGF、VEGFR1、VEGFR2、Eph B4、Ephrin B2表达水平明显增加,Notch4表达下调;采用DAPT干预后,细胞内Dll4、Notch1、VEGF、VEGFR2表达增加,Notch4表达上调;采用葛根素干预后,细胞内Dll4、Notch1、VEGFR2表达下降,VEGF和Notch4无明显变化;采用黄芪甲苷干预后,细胞内Dll4、Notch1、VEGF表达下降,Notch4表达升高,VEGFR2无明显变化;采用野黄芩素干预后,VEGF和VEGFR2表达下降。VEGFR1、Eph B4、Ephrin B2在各干预组内均无明显变化。结论:1.人脐静脉内皮细胞作为体外研究糖尿病视网膜病变的细胞模型时,最佳葡萄糖浓度为30mmol/L,并建议在此浓度下至少培养48h;2.芪灯明目胶囊三种有效成分均能在特定浓度范围内能保护高糖环境下内皮细胞活性,降低高糖对细胞的损害作用,并且能够部分抑制高糖诱导的内皮细胞迁移;3.芪灯明目胶囊三种有效成分对高糖环境下Dll4/Notch-VEGF信号通路的主要信号分子有调节作用,但葛根素、黄芪甲苷、野黄芩素在作用靶点上各有不同,葛根素作用靶点集中在Notch信号通路上,黄芪甲苷对Notch和VEGF信号通路均有作用,而野黄芩素的作用靶点主要针对VEGF信号通路。


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