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基于PI3K/AKT/mTOR信号通路研究补肾活血法调控大鼠卵巢颗粒细胞自噬的分子机制

白俊  
【摘要】:实验一雷公藤甲素诱导离体原代培养大鼠卵巢颗粒细胞自噬的研究目的:观察雷公藤甲素(triptolide,TP)诱导颗粒细胞(granulosa cells,GCs)自噬所需的浓度、时间和作用机制。方法:1.采用CCK-8法比较不同浓度的TP对原代培养大鼠卵巢GCs的抑制作用并计算IC50;WB法检测不同浓度、时间点下TP对GCs自噬相关因子蛋白表达及PI3K/AKT/mTOR通路级联的影响。2.WB法检测TP、自噬诱导剂(BrefeldinA)、PI3K/mTOR抑制剂(NVP-BEZ235)分别干预GCs对PI3K/AKT/mTOR通路及自噬相关因子蛋白表达的影响。结果:1.不同浓度TP作用于大鼠卵巢GCs的IC50为14.65μM,其中最小抑制浓度为0.1μM(100nM)。2.与空白对照组相比,各组Beclin1、LC3II蛋白表达水平均升高,LC3I及p62蛋白表达水平均下降,其中TP(100nM)作用与大鼠GCs12h,各指标变化显著(p0.05或p0.01);3.TP,BrefeldinA,NVP-BEZ235分别处理大鼠GCs12h后,与空白对照组相比,TP可显著促进下游自噬效应分子Beclin1,LC3II蛋白表达水平并抑制LC3I,p62蛋白表达水平(P0.05或P0.01),且TP组Beclin 1和LC3II/LC3I的表达高于Brefeldin A组,p62的表达低于Bredeldin A组(p0.05或p0.01)。同时,TP能显著抑制p-PI3K,p-AKT,p-mTOR蛋白表达水平,且TP抑制效果优于NVP-BEZ235组。结论:TP(100nM)作用于离体培养大鼠卵巢GCs12h,可成功诱导GCs自噬;TP可能是通过抑制PI3k/Akt/mTOR信号通路诱导GCs自噬。实验二基于PI3K/AKT/mTOR信号通路研补肾活血中药复方新加归肾丸对雷公藤甲素致大鼠卵巢颗粒细胞自噬的调控目的:以PI3K/AKT/mTOR通路为切入点,探讨补肾活血法调控体外培养大鼠卵巢GCs自噬的分子机制。方法:1.药效实验:将原代培养的大鼠卵巢GCs分为6组:空白对照组、模型组、中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组、西药(FSH)组。空白对照组给予生理盐水灌胃的大鼠血清,其余五组先加TP诱导12h后,模型组给予生理盐水灌胃的大鼠血清,中药各剂量组分别加入相应剂量的大鼠含药血清、FSH组加入含FSH大鼠血清,血清孵育48小时后,Elisa法检测各组GCs中E_2、P分泌量;RT-qPCR法、WB法和免疫荧光法分别检测各组GCs中PI3K、AKT、mTOR、Beclin1、LC3、p62的mRNA表达和Beclin1、LC3、p62及p-PI3K、p-AKT、p-mTOR的蛋白表达。2.机制实验:将原代培养的大鼠卵巢GCs分为5组:空白对照组、模型组、中药高剂量组、抑制剂组、中药高剂量+抑制剂组。空白对照组给予生理盐水灌胃的大鼠血清,其余四组先加TP诱导12h后,模型组给予生理盐水灌胃的大鼠血清,中药高剂量组加入中药高剂量大鼠含药血清,抑制剂组加入生理盐水灌胃的大鼠血清和抑制剂,中药高剂量+抑制剂组加入中药高剂量灌胃的大鼠含药血清和抑制剂,48小时后,透射电镜下观察各组GCs中的自噬小体数量,其余检测指标及方法均同药效实验。结果:1.药效实验:(1)Elisa法:与空白对照组相比,模型组E2含量显著降低,与模型组相比,中药各剂量组E2含量均上升(均p0.05),且中药高剂量组与FSH组E_2含量均升高,两组差异无统计学意义(p0.05);与空白对照组相比,各组与对P的含量均没有影响(p0.05)。(2)RT-qPCR法:与空白对照组相比,各组GCs中PI3K,AKT,mTOR的mRNA水平无明显变化(p0.05),而模型组Beclin1,LC3I,LC3II和p62的mRNA水平显著高升高(p0.01);中药各剂量组及西药FSH组Beclin 1,LC3I,LC3II和p62的mRNA水平显著下降(均p0.05);且中药高剂量组效果优于西药FSH组(均p0.05)。(3)WB法:与空白对照组相比,模型组p-PI3K、p-AKT、p-mTOR和p62的表达显著降低,Beclin 1和LC3II/I的表达则显著升高(p0.01);中药各剂量组及FSH组p-PI3K、p-AKT、p-mTOR水平和p62的表达上调,Beclin 1和LC3II/I的表达下调,且中药高剂量组效果优于西药FSH组(均p0.05)。(4)免疫荧光法:模型组p-PI3K、p-AKT、p-mTOR和P62表达降低,Beclin1、LC3II的表达升高,各中药各剂量组及阳性药物FSH组p-PI3K、p-AKT、p-mTOR和p62表达上调,Beclin 1、LC3II的表达下调,且中药高剂量组效果优于FSH组(均p0.05)。2.机制实验:(1)Elisa法:与空白对照组相比,模型组E2含量显著降低,与模型组相比,中药高剂量组E_2含量显著上升(p0.01),且中药高剂量组显著高于中药高剂量+抑制剂组(p0.01);但与空白对照组相比,各组对P的含量均没有影响(p0.05)。(2)透射电镜结果:自噬小体的数量在模型组多于空白对照组,中药高剂量组自噬小体少于模型组,且中药高剂量组自噬小体少于中药+抑制剂组。(3)RT-qPCR法:与空白对照组相比,各组PI3K,AKT和mTOR的mRNA水平无明显变化(p0.05),而模型组Beclin1,LC3I,LC3II和p62的mRNA水平显著升高(p0.01);中药高剂量组Beclin1,LC3I,LC3II和p62的mRNA水平显著下降,且中药高剂量组显著低于中药+抑制剂组(均p0.01)。(4)WB法:与空白对照组相比,模型组p-PI3K、p-AKT、p-mTOR和p62的表达显著降低,Beclin 1和LC3II/I的表达则显著升高(p0.01);中药高剂量组p-PI3K、p-AKT、p-mTOR水平和p62的表达上调,Beclin 1和LC3II/I的表达下调,且中药高剂量组p-PI3K、p-AKT、p-mTOR水平和p62的表达显著高于中药高剂量+抑制剂组,Beclin 1和LC3II/LC3I的表达显著低于中药+抑制剂组(均p0.01)。(5)免疫荧光法:模型组p-PI3K、p-AKT、p-mTOR和p62表达减少,Beclin1、LC3II的表达增多,中药高剂量组p-PI3K、p-AKT、p-mTOR和p62表达上调,Beclin 1、LC3II的表达下调,且中药高剂量组p-PI3K、p-AKT、p-mTOR和p62表达显著高于中药高剂量+抑制剂组,中药高剂量组Beclin 1和LC3II的表达显著低于中药+抑制剂组。结论:TP100nM作用于大鼠卵巢GCs12h,可显著抑制GCs分泌E2含量,中药高剂量组可显著改善TP对离体原代培养大鼠GCs分泌E2的抑制;补肾活血中药复方新加归肾丸可能是通过激活PI3K/AKT/mTOR通路,下调下游自噬效应分子Beclin1及LC3的表达并减少p62的消耗来修复TP导致的大鼠卵巢GCs的自噬损伤。


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